Przewodnik po odczynnikach do sprzęgania peptydów

Przegląd sekcji

• Materiały pokrewne
• In-situ Odczynniki aktywujące
• Phosphonium Versus Uronium Reagents
• Summary of Uronium and Phosphonum Coupling Reagents
• Referencje

Odczynniki Novabiochem^® marka oferuje jedną z najszerszych gam wysokiej jakości odczynników sprzęgających do aktywacji in situ na rynku. Jednak przy tak dużej liczbie dostępnych odczynników, wybór optymalnego odczynnika sprzęgającego do konkretnego zastosowania nie zawsze jest prosty. Odczynniki kondensacyjne różnią się pod względem wydajności sprzęgania, stabilności, rozpuszczalności lub reaktywności substancji czynnych.

Powiązane materiały

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch

Odczynniki aktywujące in situ odczynniki aktywujące

Odczynniki aktywujące in situ są powszechnie akceptowane, ponieważ są łatwe w użyciu, dają szybkie reakcje, nawet między aminokwasami z przeszkodami sterycznymi, a ich stosowanie jest generalnie wolne od reakcji ubocznych. Większość z nich opiera się na solach fosfoniowych lub aminowych (dawniej znanych jako uroniowe), które w obecności trzeciorzędowej zasady mogą płynnie przekształcać chronione aminokwasy w różne aktywowane gatunki (Rysunek 1). Właściwości odczynników sprzęgających Novabiochem^® podsumowano w Tabeli 1.

Rysunek 1. Aktywne estry generowane przy użyciu najczęściej stosowanych odczynników sprzęgających.
P1A1 = TOTU, P1A2 = HBTU/TBTU, P1A3 = HCTU, P1A4 = HATU, P1A5 = TSTU
P2A1 = COMU
P3A1 = PyOxim, P3A2 = PyBOP, P3A3 = PyClock, P3A4 = PyAOP

Najczęściej stosowane odczynniki, BOP, PyBOP i HBTU, generują estry OBt, które znalazły szerokie zastosowanie w rutynowej syntezie SPPS i roztworów do trudnych sprzężeń. Dostępne są również odczynniki sprzęgające, które generują estry bardziej reaktywne niż OBt. Najważniejsze z nich to HATU², PyAOP^1,3 i HCTU⁴, PyClocK, które w obecności zasady przekształcają kwasy karboksylowe w odpowiednie estry OAt i O-6-ClBt. Takie estry są bardziej reaktywne niż ich odpowiedniki OBt ze względu na niższe pKa HOAt i HO-6-ClBt w porównaniu do HOBt. Co więcej, HOAt ma dodatkową zaletę w postaci azotu pirydynowego, który zapewnia anchiomeryczną pomoc w reakcji sprzęgania, dzięki czemu HATU i PyAOP są najbardziej wydajnymi odczynnikami sprzęgającymi z serii OBt.

Ostatnio wprowadzono odczynniki sprzęgające oparte na grupie opuszczającej Oxyma Pure, z których najbardziej użytecznymi są COMU^5,6 i PyOxim⁷. Dowody na względną reaktywność estrów Oxyma generowanych przez te odczynniki są niejednoznaczne. Oryginalne raporty dotyczące tych odczynników opartych na Oxyma sugerują, że są one bardziej wydajne niż te oparte na HOAt, podczas gdy nasze wewnętrzne testy⁸ wskazują, że odczynniki HOAt są lepsze. Niemniej jednak odczynniki oparte na Oxyma zawsze działają lepiej niż te oparte na HOBt (PyBOP, HBTU) i O-6-ClBt (PyClocK i HCTU). Jedną ze szczególnych zalet odczynników sprzęgających opartych na Oxyma jest to, że nie są one oparte na potencjalnie wybuchowych odczynnikach triazolowych.

W naszych eksperymentach skuteczność odczynnika sprzęgającego wydaje się być prawie całkowicie związana z charakterem aktywnego estru, który generuje, z kolejnością reaktywności OAt> Oxyma Pure > 2-ClOBt > OBt.Struktura składnika uronowego lub fosfonowego wydaje się mieć niewielki wpływ.

Phosphonium Versus Uronium Reagents

Z wyjątkiem COMU, roztwory odczynników na bazie uronu w DMF są wyjątkowo stabilne, co czyni je idealnymi do stosowania w syntezatorach, które wykorzystują gotowe roztwory odczynników sprzęgających. Z kolei roztwory odczynników fosfoniowych w DMF mają umiarkowaną stabilność i powinny być przechowywane w zamkniętych fiolkach i używane przez maksymalnie 2 dni. Odczynniki fosfoniowe są jednak znacznie lepiej rozpuszczalne w DMF niż odczynniki uroniowe. Ma to ważne implikacje praktyczne, ponieważ umożliwia prowadzenie reakcji w wyższych stężeniach przy jednoczesnej poprawie wydajności.

Fosfonowe odczynniki sprzęgające generalnie dają czystsze reakcje niż odczynniki uronowe. Te ostatnie mogą powodować zakończenie łańcucha poprzez guanidinylowanie N-końcowej grupy aminowej⁹. Ta reakcja uboczna jest szczególnie problematyczna, gdy aktywacja karboksylowa jest powolna, na przykład w przypadku reakcji fragmentacji i cyklizacji, lub gdy stosowany jest nadmiar odczynnika uronowego. Powstawanie takich produktów ubocznych powoduje również trudności w montażu długich peptydów, ponieważ te krótkie dodatnio naładowane peptydy mogą maskować obecność jonu docelowego w widmie masowym ESI.  W przeciwieństwie do odczynników uronowych, odczynniki fosfoniowe mogą być stosowane w nadmiarze, a nawet mogą być stosowane do "zasilania" powolnej cyklizacji lub reakcji sprzęgania fragmentów, aby pomóc doprowadzić je do końca.

Rysunek 2. Guanidinylacja wywołana przez uronowe odczynniki sprzęgające.

Tabela 1Podsumowanie właściwości odczynników sprzęgających Novabiochem^®

Odczynnik sprzęgający	Nr prod. Nr.	Struktura	Rozpuszczalność (M)	Stabilność w zamkniętej fiolce DMF	Reaktywność substancji czynnych	Komentarze
BOP	851004		>1.5	n/a	4	Produkty uboczne rozpuszczalne w wodzie czynią go użytecznym do syntezy w fazie roztworu
COMU	851085		1.5	Niska	1/2	Wysoka reaktywność, prawdopodobnie lepsza niż HATU dla utrudnionych sprzężeń. Niewybuchowy. Ograniczona stabilność roztworu. Powoduje guanidylację.
HATU	851013		0.45	Doskonały	1	Złoty standard dla utrudnionych sprzężeń, ale drogi w porównaniu do innych odczynników
HBTU	851006		0.5	Doskonały	4	Doskonały odczynnik do rutynowej syntezy. Może powodować guanidinylację.
HCTU	851012	.	0.75	Doskonały	3	Bardziej reaktywny i droższy niż HBTU. Może powodować guanidinylację.
PyBOP	851009	.	>1.5	Umiarkowany. Roztwory wymagają codziennego przygotowywania	4	Doskonały odczynnik do rutynowej syntezy. Idealny do aktywacji in situ, ponieważ nie powoduje guanidynylacji. Czysty.
PyAOP	851221	.	>1.5	Niski - Umiarkowany. Roztwory wymagają codziennego odświeżania. Najlepiej przechowywać pod N2	1	Doskonały odczynnik do sprzęgania z przeszkodami, kondensacji fragmentów i cyklizacji peptydów. Idealny do aktywacji in situ, ponieważ nie powoduje guanidynylacji. Czysty.
PyOxim	851095		>1.5	Umiarkowane. Roztwory wymagają codziennego przygotowywania	1/2	Podobne zalety do PyBOP, ale generuje bardziej reaktywne gatunki aktywne. Czysty.
TSTU	851206	.	n/a	Doskonały	4	Użyteczny do konwersji barwników/odczynników PEG do estrów OSu kompatybilnych z wodą

Podsumowanie odczynników sprzęgających uron i fosfon

Uronium	Phosphonium
Syntezatory, w których roztwory są przechowywane w zamkniętych pojemnikach.Syntezatory wykorzystujące roztwory podstawowe, zwłaszcza jeśli roztwory są otwarte na działanie atmosfery	Syntezatory, w których roztwory są przechowywane w zamkniętych pojemnikach, a odczynniki są szybko zużywane
Skalowanie, jeśli koszt odczynnika jest brany pod uwagę	Skalowanie, jeśli stężenie odczynnika jest brane pod uwagę
Nie można stosować w nadmiarze podczas kondensacji fragmentów i cyklizacji	Można stosować w nadmiarze podczas kondensacji fragmentów i cyklizacji

Referencje

1. Albericio F, Cases M, Alsina J, Triolo SA, Carpino LA, Kates SA. 1997. On the use of PyAOP, a phosphonium salt derived from HOAt, in solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 38(27):4853-4856. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(97)01011-3

2. Carpino LA. 1993. 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole. An efficient peptide coupling additive. J. Am. Chem. Soc.. 115(10):4397-4398. https://doi.org/10.1021/ja00063a082

3. Albericio F, Bofill JM, El-Faham A, Kates SA. 1998. Use of Onium Salt-Based Coupling Reagents in Peptide Synthesis1. J. Org. Chem.. 63(26):9678-9683. https://doi.org/10.1021/jo980807y

4. Marder O, Shvo Y, Albericio F. 2003. HCTU and TCTU: New Coupling Reagents ? Development and Industrial Aspects. ChemInform. 34(32): https://doi.org/10.1002/chin.200332258

5. El-Faham A, Funosas RS, Prohens R, Albericio F. 2009. COMU: A Safer and More Effective Replacement for Benzotriazole-Based Uronium Coupling Reagents. Chem. Eur. J.. 15(37):9404-9416. https://doi.org/10.1002/chem.200900615

6. Subirós-Funosas R, Nieto-Rodriguez L, Jensen KJ, Albericio F. 2013. COMU: scope and limitations of the latest innovation in peptide acyl transfer reagents. J. Pept. Sci.. 19(7):408-414. https://doi.org/10.1002/psc.2517

7. Subirós-Funosas R, El-Faham A, Albericio F. 2010. PyOxP and PyOxB: the Oxyma-based novel family of phosphonium salts. Org. Biomol. Chem.. 8(16):3665. https://doi.org/10.1039/c003719b

8. Novabiochem Innovations 03/10.. [Internet]. Available from: https://www.merckmillipore.com/IN/en/reagents-chemicals-and-labware/novabiochem-learning-center/novabiochem-publications/novabiochem-innovations/J2ib.qB.rDYAAAFLHaQp.xHd,nav?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F&bd=1

9. Gausepohl H, Pieles U, Frank R. 1992. Peptides: chemistry and biology. ESCOM. Leiden.523.