Odczynniki do biotynylacji

• Biotinylated Peptide Design
• AlphaScreen™ Protein-binding Assay
• Test wiązania kinazy
• Materiały
• Referencje

Peptydy znakowane biotyną mają wiele ważnych zastosowań w immunologii i histochemii, takich jak oczyszczanie powinowactwa¹ i cytometria przepływowa oparta na FRET², testy immunologiczne w fazie stałej³ i lokalizacja receptorów⁴, które wykorzystują wysokie powinowactwo streptawidyny i awidyny do biotyny.

Wbudowanie etykiety biotynowej najlepiej przeprowadzić podczas syntezy ligandu peptydowego w fazie stałej, przy czym optymalna lokalizacja etykiety biotynowej zależy od charakteru zastosowania.

Żywica Biotin NovaTag

Fmoc-PEG Biotyna NovaTag

Etykieta biotyny jest najczęściej umieszczana bezpośrednio na N-końcowej grupie peptydu, często bez względu na to, jak może to wpływać na interakcje peptyd-cel, wiązanie biotyna-awidyna i właściwości rozpuszczalności powstałego peptydu. W wielu przypadkach produkty są słabo rozpuszczalne i mają niewielką aktywność biologiczną oraz słabe powinowactwo do biotyny. Problemy mogą również pojawić się podczas syntezy takich N-końcowo biotynylowanych peptydów ze względu na słabą rozpuszczalność i reaktywność wielu odczynników stosowanych do wprowadzania biotyny.

Żywice NovaTag™ firmy Novabiochem^® załadowane biotyną zapewniają proste i eleganckie rozwiązanie tych problemów^5-9. Używając tych żywic, biotynylowane peptydy są otrzymywane bezpośrednio po rozszczepieniu TFA, bez potrzeby jakichkolwiek dodatkowych etapów biotynylacji. Żywice zawierają etylenodiaminę lub 15-atomową przekładkę PEG między peptydem a biotyną w celu zmniejszenia przeszkód sterycznych.

Zastosowanie żywicy Fmoc-PEG Biotin NovaTag™ jest szczególnie korzystne, ponieważ nie tylko hydrofilowy łańcuch PEG zapewnia lepszą rozpuszczalność peptydowego koniugatu biotyny, ale jego wydłużona konformacja prowadzi do lepszego wiązania awidyny, co może znacznie poprawić czułość testu, jak pokazano na Rysunku 2.

Żywica Fmoc-PEG Biotin NovaTag™ może być stosowana bezpośrednio w automatycznym syntezatorze w taki sam sposób jak żywica amidowa Rink. Grupa Fmoc jest usuwana za pomocą 20% piperydyny, a peptyd jest montowany na nośniku przy użyciu standardowych protokołów. Rozszczepienie z żywicy przy użyciu standardowych koktajli TFA daje C-końcowo znakowany peptyd biotynylowany.

Projektowanie biotynylowanych peptydów

Przy projektowaniu biotynylowanych peptydów do użytku w testach, dwie najważniejsze kwestie to pozycja ugrupowania biotyny i charakter grupy dystansowej między peptydem a biotyną. Mogą one znacząco wpływać na siłę interakcji peptyd-białko i biotyna-awidyna, a w konsekwencji na czułość testu. Znaczenie prawidłowej prezentacji peptydu zostało zilustrowane w poniższych przykładach zaczerpniętych z prac rozwojowych nad testami wiązania białek i kinaz przeprowadzonymi w Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy¹⁰.

.

Test wiązania białek AlphaScreen™

Test wiązania peptyd-białko został przeprowadzony przy użyciu technologii AlphaScreen™, jak pokazano na Rysunku 1. N- i C-końcowo znakowane biotyną wersje natywnego ligandu peptydowego unieruchomionego na kulkach donorowych pokrytych streptawidyną zostały sprawdzone względem kulek akceptorowych obciążonych białkiem docelowym. Tylko peptyd znakowany C-końcową biotyną PEG miał akceptowalną rozpuszczalność w buforze testowym i wykazywał znaczący poziom wiązania białka (Rysunek 2).

Rysunek 1. Zasady testu wiązania białko-peptyd AlphaScreen™.

Rysunek 2. Test wiązania białka AlphaScreen. Peptyd 1: N-biotyna-XXXXX-NH₂; peptyd 2: H-XXXXX-NHCH₂CH₂NH-biotyna; peptyd 3: H-XXXXX-NH-PEG-NH-biotyna¹⁰.

Test wiązania kinazy

N- i C-końcowo znakowane biotyną wersje substratu kinazy oceniano w teście pokazanym na Rysunku 3. Stwierdzono, że peptydy znakowane C-końcowo biotyną dają lepsze odpowiedzi niż te znakowane na N-końcu, podczas gdy włączenie przekładki PEG między peptydem a biotyną wydaje się mieć niewielki wpływ (Rysunek 4).

Rysunek 3. Zasady testu kinazowego

Rysunek 4. Test kinazy. Peptyd 4: biotyna-KKKXXLLDXXXXXXXXXXXMKDEE-NH₂; peptyd 5: H-KKKXXLLDXXXXXXXXXMKDEE-NHCH₂CH₂NH-biotyna; peptyd 6; biotyna-NH-PEG-KKKXXLLDXXXXXXXXXMKDEE-NH₂ ; peptyd 7: H-KKKXXLLDXXXXXXXMKDEE-NH-PEG-NH-biotyna¹⁰.

Biotin-OSu

Biotin-ONp

Fmoc-Lys(biotyna)-OH

Fmoc-Lys(biotynylo-ε-aminokaproilo)-OH

Fmoc-Asp(biotynylo-PEG)-OH

Fmoc-Glu(biotynylo-PEG)-OH

N-Biotinyl-NH-PEG2-COOH.

N-Biotynylo-NH-PEG11-COOH

Do sprzęgania biotyny z aminami na fazie stałej zdecydowanie zaleca się stosowanie Biotin-ONp¹¹. Rozpuszczalność tego odczynnika w DMF lub NMP jest znacznie większa niż biotyny-OSu (Tabela 1) i znacznie szybciej łączy się on z aminami (Rysunek 5): zazwyczaj w ciągu 40 min w przeciwieństwie do 12 h dla Biotin-OSu.

Tabela 1. Właściwości żywic bazowych

Rozpuszczalność (mmole/ml)
Związek	DCM	DMF	.NMP
Biotin-OSu	>0.02	0.1	0.15
Biotin-ONp	0.09	0.5	0.5
Fmoc-Lys(biotin)-OH	<0.025	<0.05	0.25
Fmoc-Lys(biotinyl-e-aminocaproyl)-OH	<0.025	0.5	0.5
SFmoc-Glu(biotinyl-PEG)-OH	<0.025	0.5	0.5

Rysunek 5. Szybkość sprzęgania biotyny-OSu i biotyny-ONp z żywicą H-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Glu(OtBu)-Wang.

Alternatywnie, preformowane pochodne, takie jak Fmoc-Lys(biotin)-OH, Fmoc-Lys(biotinyl-e-aminocaproyl)-OH, Fmoc-Asp(biotinyl-PEG)-OH oraz Fmoc-Glu(biotinyl-PEG)-OH mogą być stosowane do wprowadzania biotyny w precyzyjnym miejscu w łańcuchu peptydowym. Szczególnie zalecane jest stosowanie Fmoc-Glu(biotinyl-PEG)-OH. W przeciwieństwie do innych pochodnych, posiada dobrą rozpuszczalność w DMF (Fmoc-Glu(biotinyl-PEG)-OH, 0,5 mmole/ml; Fmoc-Lys(biotinyl)-OH, <0,05 mol/ml; Fmoc-Lys(biotinyl-e-aminocaproyl)-OH, <0,05 mmole/ml). Ponadto, łańcuch PEG poprawia rozpuszczalność produktu biotynylowanego peptydu [1b] i pomaga zmniejszyć przeszkodę steryczną między peptydem a biotyną, prowadząc do lepszego wiązania awidyny. Zaleca się stosowanie NMP lub NMP/DMSO jako rozpuszczalników dla Fmoc-Lys(biotyna)-OH i Fmoc-Lys(biotynylo-e-aminokaproilo)-OH. Dla wygody dostępny jest Fmoc-Lys(biotinyl-e-aminocaproyl)-OH wstępnie załadowany na żywicę NovaSyn^® TGR A.

N-Biotynylo-NH-PEG₂-COOH i N-Biotynylo-NH-PEG₁₁-COOH oferują takie same korzyści jak Fmoc-Glu(biotinyl-PEG)-OH i są idealne do przyłączania biotyny-PEG na N-końcu peptydu. Długa 40-atomowa przekładka w tym ostatnim ma wyraźny wpływ na rozpuszczalność peptydu w porównaniu z Glu (biotinyl-PEG) lub N-biotinyl-NH-PEG.

Referencje

1. Hofmann K, Kiso Y. 1976. An approach to the targeted attachment of peptides and proteins to solid supports.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 73(10):3516-3518. https://doi.org/10.1073/pnas.73.10.3516

2. T. Buranda, . (1999). et al. Cytometry, . 37, 21.

3. Sélo I, Négroni L, Créminon C, Grassi J, Wal J. 1996. Preferential labeling of ?-amino N-terminal groups in peptides by biotin: application to the detection of specific anti-peptide antibodies by enzyme immunoassays. Journal of Immunological Methods. 199(2):127-138. https://doi.org/10.1016/s0022-1759(96)00173-1

4. HOWL J, WANG X, KIRK CJ, WHEATLEY M. 1993. Fluorescent and biotinylated linear peptides as selective bifunctional ligands for the V1a vasopressin receptor. Eur J Biochem. 213(2):711-719. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1993.tb17811.x

5. Kumar V, Aldrich JV. 2003. A Solid-Phase Synthetic Strategy for Labeled Peptides:? Synthesis of a Biotinylated Derivative of the ? Opioid Receptor Antagonist TIPP (Tyr-Tic-Phe-Phe-OH). Org. Lett.. 5(5):613-616. https://doi.org/10.1021/ol027044s

6. Carraz M, Zwart W, Phan T, Michalides R, Brunsveld L. 2009. Perturbation of Estrogen Receptor ? Localization with Synthetic Nona-Arginine LXXLL-Peptide Coactivator Binding Inhibitors. Chemistry & Biology. 16(7):702-711. https://doi.org/10.1016/j.chembiol.2009.06.009

7. Parisot J, Kurz K, Hilbrig F, Freitag R. 2009. Use of azobenzene amino acids as photo-responsive conformational switches to regulate antibody-antigen interaction. J. Sep. Science. 32(10):1613-1624. https://doi.org/10.1002/jssc.200800698

8. Shiryaev S, Kozlov I, Ratnikov B, Smith J, Lebl M, Strongin A. 2007. Cleavage preference distinguishes the two-component NS2B?NS3 serine proteinases of Dengue and West Nile viruses. 401(3):743-752. https://doi.org/10.1042/bj20061136

9. Millward SW, Fiacco S, Austin RJ, Roberts RW. 2007. Design of Cyclic Peptides That Bind Protein Surfaces with Antibody-Like Affinity. ACS Chem. Biol.. 2(9):625-634. https://doi.org/10.1021/cb7001126

10. O. Pöschke. unpublished results..

11. Baumeister B, Beythien J, Ryf J, Schneeberger P, White PD. 2005. Evaluation of Biotin-OSu and Biotin-ONp in the Solid Phase Biotinylation of Peptides. Int J Pept Res Ther. 11(2):139-141. https://doi.org/10.1007/s10989-004-4707-2

12. B. Baumeister, et al.. 2003. Biopolymers. 71(339):