Żywice bazowe do syntezy peptydów

Linia produktów Novabiochem^® posiada jedną z najszerszych gam nośników polimerowych do syntezy peptydów w fazie stałej. Obejmują one zarówno żywice o wysokim obciążeniu i niskim pęcznieniu do produkcji na dużą skalę stosunkowo krótkich peptydów, jak i żywice o wysokim obciążeniu i niskim pęcznieniu do syntezy długich lub trudnych sekwencji.

Do syntezy peptydów preferowane jest stosowanie żywic o małych rozmiarach cząstek i niskim stopniu usieciowania. Takie żywice pozwalają na szybką dyfuzję odczynników wewnątrz kulek, a ich pęcznienie pozwala im lepiej pomieścić większość rosnącego łańcucha peptydowego. Najczęściej stosowane żywice oparte są na 1% polistyrenie usieciowanym diwinylobenzenem. Są one stosunkowo tanie, łatwe w obsłudze i mają wysoki stopień podstawienia. Zwykle stosuje się je do syntezy wsadowej, z mieszaniem gazowym, wytrząsaniem, mieszaniem łopatkowym lub odwracaniem naczynia do mieszania. Można je jednak również stosować w syntezie w przepływie ciągłym, pod warunkiem zastosowania niskiego natężenia przepływu lub upakowania żywicy z kulkami szklanymi, chociaż do tego zastosowania preferowane są żywice kompozytowe NovaSyn^® TG, NovaGel™ lub PEGA. W tym przypadku solwatacja PEG nadaje polimerowi stabilność ciśnieniową, dzięki czemu nadają się one do stosowania w systemach z pompowanym przepływem.

Tabela 1. Właściwości żywic bazowych

	Kompozycja	Rozmiar kulki (mm)/mesh	Ładowanie	DMF	H20	DCM	Zastosowanie	Komentarze
Polistyren	Styren usieciowany diwinylobenzenem	75 - 150/ 100 - 200	0.5 -1.0	3	0	7	Synteza rutynowa i na dużą skalę	Najbardziej opłacalna, ale może zawieść przy syntezie trudnych lub długich sekwencji<
NovaSyn® TG	PEG szczepiony na polistyrenie	90/160	0.2 - 0.3	5	4	5	Skala badawcza średnich i długich peptydów	Odporny na ciśnienie, dzięki czemu idealny do ciągłego przepływu
NovaSyn® TGR	PEG szczepiony na polistyrenie	90/160	0.2 - 0.3	5	4	5	Skala badawcza średnich i długich peptydów	Specjalna formuła żywicy NovaSyn TG, która daje jeszcze lepsze wyniki dla długich peptydów. Działa szczególnie dobrze przy ogrzewaniu mikrofalowym
.PEGA	Kopolimer poliakrylamid-PEG	150 - 300/ 100 - 300	0.2 - 0.4	11	16	13	Testy enzymatyczne na kulce	Wewnętrzna przestrzeń kulki dostępna dla wielu białek
NovaGel™ (Champion)	PEG szczepiony na polistyrenie	75 - 150/ 100 - 200	0.6 - 0.8	7	n/d	n/d	Synteza peptydów średniej długości	Wysokie obciążenie i wysoka zawartość PEG czynią go idealnym do przygotowywania peptydów średniej długości w dużych ilościach.

NovaSyn^® TG żywice

NovaSyn^®TG i NovaSyn^® TG^R żywice¹ oparte są na kompozycie nisko usieciowanego hydroksyetylopolistyrenu i glikolu polietylenowego, który został sfunkcjonalizowany terminalnie. Żywica NovaSyn^® TG jest dostępna w postaci kulek o wielkości 90 µm i 130 µm. Żywica o mniejszym rozmiarze kulek jest ogólnie preferowana do syntezy peptydów i bibliotek peptydów; 1 g zawiera prawie wystarczającą liczbę kulek do reprezentowania pentamerycznej biblioteki peptydów. Większa pojemność dużych kulek sprawia, że żywica 130 µm jest idealna do produkcji bibliotek niepeptydowych.

Żywice te nadają się zarówno do ciągłego przepływu, jak i wsadowej syntezy peptydów. Żywice NovaSyn^® TG^R zostały specjalnie zaprojektowane do syntezy długich i trudnych sekwencji. Charakteryzują się one doskonałą stabilnością fizyczną w systemach przepływowych, są odporne na ścieranie i nacisk mechaniczny oraz oferują lepszą wydajność chemiczną. Stwierdzono nawet, że wysokie prędkości przepływu zwiększają szybkość acylacji i deprotekcji żywic NovaSyn^® TG². Żywice NovaSyn^®TG są również zalecane do stosowania z podejściem "jedna kulka - jeden związek" do bibliotek chemicznych. Kulki mają wąski rozkład wielkości i pęcznieją w wodzie, ułatwiając testy biologiczne w układach wodnych. Żywice pęcznieją w szerokim zakresie rozpuszczalników, od toluenu po wodę, a środowisko zapewniane przez PEG jest uważane za bardzo podobne do tego występującego w THF.

PEG jest zakotwiczony w żywicach NovaSyn^®TG do szkieletu polistyrenowego za pomocą niewrażliwego na kwasy eteru etylofenylowego. Wyciek PEG, który według wielu doniesień jest związany ze stosowaniem tych żywic, nie jest spowodowany żadną niestabilnością kwasową, ale powstaje w wyniku tworzenia nadtlenków PEG w wyniku działania tlenu i światła podczas długotrwałego przechowywania. Degradacja ta jest nieodłączną właściwością wszystkich żywic PEG. Niekorzystne porównania między NovaSyn^®TG i innymi podobnymi nośnikami opartymi na PEG prawie na pewno odzwierciedlają różnice w wieku i historii przechowywania badanych próbek, a nie jakiekolwiek fundamentalne różnice w stabilności chemicznej.

Rysunek 1. Struktura żywicy NovaSyn^® TG.

Żywice PEGA

Żywice PEGA są hydrofilowymi polimerami, które zostały pierwotnie opracowane do wsadowej i ciągłej syntezy peptydów⁴ ale które są również stosowane w SPOS. Składają się one z 2-akrylamidoprop-1-ylo-(2-aminoprop-1-ylo) glikolu polietylenowego₈₀₀ i dimetyloacyloamidu usieciowanego bis 2-akrylamidoprop-1-ylo glikolem polietylenowym₈₀₀. Nośniki te intensywnie pęcznieją w szerokim zakresie rozpuszczalników, w tym w wodzie, DMF, DCM, THF i MeOH, i są swobodnie przepuszczalne dla makrocząsteczek do 35kD, dzięki czemu idealnie nadają się do przygotowywania bibliotek peptydów, oczyszczania powinowactwa i testów enzymatycznych na żywicy. Właściwości te zostały wykorzystane w enzymatycznej syntezie glikopeptydów na żywicy [5]; do określenia inhibitorów subtilizyny Carlsberg⁶, Cruzipain⁷, proteaz cysteinowych⁸ i metaloproteinaz macierzy⁹; oraz w badaniach nad izomerazami disiarczkowymi białek, przy użyciu bibliotek wygaszanych fluorescencyjnie¹⁰.

Smith & Bradley¹¹ porównali biblioteki poliamin w roztworze i w fazie stałej w teście przeciwko reduktazie trypanationowej. Biblioteka na żywicy PEGA działała równie dobrze jak ta w roztworze, podczas gdy biblioteka na żywicy TG nie działała.

Rysunek 2. Struktura żywicy PEGA

Żywice NovaGel™

NovaGel™, znana również jako żywica Champion, jest rodzajem żywicy PEG-PS, która została zaprojektowana, aby spełnić wymagania chemików dotyczące żywic o wysokim podstawieniu i szerokiej kompatybilności z rozpuszczalnikami. Jest ona przygotowywana ze specjalnej wersji żywicy aminometylowanej o wysokim stopniu pęcznienia poprzez częściową derywatyzację za pomocą metylo-PEG₂₀₀₀-p-nitro-fenylowęglanu^2-3. W ten sposób uzyskuje się żywicę zawierającą około 48% PEG, z podstawieniem 0,7 mmole/g, czyli prawie dwukrotnie więcej niż w przypadku konwencjonalnych nośników PEG-PS. Żywica pęcznieje w rozpuszczalnikach o bardzo różnej polarności, takich jak THF, DMF, acetonitryl i metanol, co czyni ją doskonałym wsparciem zarówno dla syntezy peptydów, jak i organicznej.

Powiązanie uretanowe między PEG a żywicą bazową jest stabilne dla piperydyny i TFA, zapewniając minimalną utratę łańcuchów PEG podczas syntezy. Jeśli jednak dojdzie do wymywania PEG, nie spowoduje to utraty substytucji, jak może mieć to miejsce w przypadku innych żywic opartych na PEG-PS, ponieważ łącznik nie jest przymocowany do końca łańcuchów PEG.

.

Rysunek 3. Struktura żywicy NovaGel

Referencje

1. W. Rapp et al. 1989. Peptides 1988, Proc. 20st European Peptide Symposium. G. Jung & E. Bayer (Eds.); Walter de Gruyter p. pp. 199..

2. W. Rapp, et al.. 1990. Innovation and Perspectives in Solid Phase Synthesis. R.Epton (Ed.). pp. 205.: SPCC (UK) Ltd Birmingham.

3. L. Zhang et al.. 1990. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. E. Giralt & D. Andreu (Eds); ESCOM: Leiden. p. pp. 196..

4. Bayer E. 1991. Towards the Chemical Synthesis of Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 30(2):113-129. https://doi.org/10.1002/anie.199101133

5. EBea. 1983. “Peptides Structure and Function”. V.J. Hubry & D.M. Rich (Eds.) Pierce Chemical Company Rockford. pp. 87:

6. WRaEB, J(. 1992. “Polyethyleneglycol chemistry, Biochemical and Biomedical Applications”. pp.325 . Plenum Press:

7. WRea. 1995. “Peptides 1994, Proc. 23rd European Peptide Symposium”. H. Maia (Ed.); pp. 87. ESCOM Leiden

8. Adams JH, Cook RM, Hudson D, Jammalamadaka V, Lyttle MH, Songster MF. 1998. A Reinvestigation of the Preparation, Properties, and Applications of Aminomethyl and 4-Methylbenzhydrylamine Polystyrene Resins1. J. Org. Chem.. 63(11):3706-3716. https://doi.org/10.1021/jo9802269

9. DHea. 1999. "Peptides 1998: Proceedings of the 25th European Peptide Symposium". S. Bajusz & F. Hudecz Akadémiai Kiadó, Budapest pp. 40.;

10. Meldal M. 1992. Pega: a flow stable polyethylene glycol dimethyl acrylamide copolymer for solid phase synthesis.. Tetrahedron Letters. 33(21):3077-3080. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)79604-3

11. Meldal M, Auzanneau F, Hindsgaul O, Palcic MM. A PEGA resin for use in the solid-phase chemical?enzymatic synthesis of glycopeptides. J. Chem. Soc., Chem. Commun.. 0(16):1849-1850. https://doi.org/10.1039/c39940001849