Kriokonserwacja linii komórkowych

Porady i wskazówki dotyczące zamrażania komórek

Zachowanie linii komórkowych poprzez kriokonserwację pomaga utrzymać cenne zasoby laboratoryjne. Jeśli nie zostanie to wykonane prawidłowo, zamrożenie linii komórkowych może spowodować uszkodzenie komórek, zakłócić eksperymenty i negatywnie wpłynąć na gromadzenie danych. Niniejszy samouczek przedstawia protokół zamrażania komórek, porady i wskazówki pomagające zminimalizować uszkodzenia komórek podczas zamrażania oraz różne roztwory stosowane jako pożywki do kriokonserwacji.

Poniższy protokół opisuje zastosowanie metod zamrażania komórek z wykorzystaniem elektrycznej zamrażarki -80 °C do kriokonserwacji linie komórkowe. ECACC rutynowo korzysta z programowalnej zamrażarki z kontrolowaną szybkością. Jest to najbardziej niezawodny i powtarzalny sposób zamrażania komórek, ale ponieważ koszt takiego sprzętu jest poza zasięgiem większości laboratoriów badawczych, poniższe metody zostały opisane szczegółowo. Jeśli regularnie zamrażana jest duża liczba kultur komórkowych, zaleca się stosowanie zamrażarki z programowalną regulacją szybkości.

Czytaj więcej o

• Cel
• Materiały
• Sprzęt
• Key Points
• Procedura
• Powiązane produkty

AIM

Ocena komórek

Zbierz komórki (protokoły 3 i 4)

Ponownie zawiesić komórki w świeżym podłożu

Usunąć próbkę i policzyć komórki (protokół 6)

Odwirować pozostałą kulturę 150 x g przez 5 minut

Ponownie zawiesić komórki w pożywce zamrażającej

Odmierzyć pipetą 1 ml alikwoty komórek

Przeniesienie do zbiornika do przechowywania ciekłego azotu

Materiały

• Podłoże do zamrażania (zwykle 90% FBS, 10% DMSO (C6164) lub glicerol (C6039))
• 70% (v/v) alkohol w sterylnej wodzie (793213).)
• PBS bez Ca2+/Mg2+ (D8537)
• 0.05% trypsyna/EDTA w HBSS, bez Ca2+/Mg2+ (T3924)
• DMSO (D2650)

Equipment

• Środki ochrony osobistej (sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny)
• Maska ochronna na całą twarz/przyłbica
• Łaźnia wodna ustawiona na 37 °C
• Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego na odpowiednim poziomie hermetyczności
• Wirówka
• Hemocytometr (Bright-Line™ hemocytometr Nr produktu. Z359629, Improved Neubauer-Camlab CCH.AC1)
• Znakowane ampułki/kariotuby
• Urządzenie do zamrażania komórek (np. Nalgene^® Mr. Frosty Product No. C1562)

Key Points

1. Najczęściej stosowanym krioprotektantem jest sulfotlenek dimetylu (DMSO), jednak nie jest on odpowiedni dla wszystkich linii komórkowych, np.HL60, gdzie DMSO jest stosowany do indukowania różnicowania. W takich przypadkach należy użyć alternatywy, takiej jak glicerol (szczegółowe informacje na temat właściwego krioprotektantu można znaleźć w karcie danych ECACC).
2. Pożywka do zamrażania ECACC zalecana powyżej okazała się być dobrą uniwersalną pożywką dla większości typów komórek. Inną powszechnie stosowaną formułą pożywki do zamrażania jest: 70% pożywka podstawowa, 20% FBS, 10% DMSO, ale może ona nie być odpowiednia dla wszystkich typów komórek. Przed regularnym stosowaniem pożywki należy sprawdzić, czy jest ona odpowiednia dla posiadanych komórek.
3. Konieczne jest, aby hodowle były zdrowe i znajdowały się w fazie logarytmicznego wzrostu. Można to osiągnąć stosując wstępnie przepełnione kultury (kultury, które są poniżej maksymalnej gęstości komórek) i zmieniając podłoże hodowlane 24 godziny przed zamrożeniem.
4. Szybkość chłodzenia może się różnić, ale jako ogólny przewodnik szybkość między -1 °C a -3 °C na minutę okaże się odpowiednia dla większości kultur komórkowych.
5. Alternatywą dla systemu Mr. Frosty jest pasywna zamrażarka Taylor Wharton, w której ampułki są utrzymywane w oparach ciekłego azotu w szyjce Dewara. System ten pozwala na stopniowe obniżanie temperatury ampułek. Dostępne są również zamrażarki z regulowaną prędkością, które są szczególnie przydatne w przypadku regularnego zamrażania dużej liczby ampułek.
6. W ostateczności, jeśli żadne inne urządzenia nie są dostępne, ampułki można umieścić w dobrze izolowanym pudełku (takim jak pudełko styropianowe o bokach o grubości co najmniej 1 cm) i umieścić w temperaturze -80 °C na noc. Ważne jest, aby upewnić się, że pudełko pozostaje w pozycji pionowej przez cały proces zamrażania. Po zamrożeniu ampułki powinny zostać przeniesione do fazy parowej naczynia do przechowywania ciekłego azotu, a ich lokalizacja powinna zostać zapisana.
7. W przypadku korzystania z metody zamrażania obejmującej zamrażarkę o temperaturze -80 °C ważne jest, aby mieć przydzieloną sekcję do zamrażania linii komórkowych, aby próbki nie zostały przypadkowo usunięte. Jeśli stanie się to w kluczowej części procesu zamrażania, będzie to miało negatywny wpływ na żywotność i wskaźniki odzysku.

Rysunek 2. Butelki DMSO

Rysunek 3. Pojemniki Mr. Frosty

Procedura

1. Przeglądaj hodowle za pomocą odwróconego mikroskopu, aby ocenić stopień zagęszczenia komórek i potwierdzić brak zanieczyszczeń bakteryjnych i grzybiczych. Zbierz komórki w fazie logarytmicznego wzrostu. W przypadku przylegających linii komórkowych należy zebrać komórki jak najbliżej 80-90% konfluencji.
2. Zawiesić przylegające i częściowo przylegające komórki przy użyciu trypsyny/EDTA, jak opisano wcześniej i ponownie zawiesić w objętości świeżej pożywki co najmniej równej objętości trypsyny. Linie komórkowe w zawiesinie mogą być używane bezpośrednio.
3. Pobierz małą porcję komórek (100-200 μl) i wykonaj zliczanie komórek. Idealnie, żywotność komórek powinna przekraczać 90% w celu osiągnięcia dobrego odzysku po zamrożeniu.
4. Wiruj pozostałą hodowlę z prędkością 150 x g przez 5 minut.
5. Zawieś ponownie komórki w stężeniu 2-4x10⁶ komórek na ml w pożywce do zamrażania.
6. Odmierzyć pipetą 1 ml podwielokrotności komórek do krioprotekcyjnych ampułek oznaczonych nazwą linii komórkowej, numerem pasażu, numerem partii, stężeniem komórek i datą.
7. Umieścić ampułki w pasywnej zamrażarce, np. w pojemniku do zamrażania Nalgene Mr. Wypełnij zamrażarkę alkoholem izopropylowym i umieść w temperaturze -80°C na noc.
8. Zamrożone ampułki powinny zostać przeniesione do fazy parowej naczynia do przechowywania ciekłego azotu, a ich lokalizacje zapisane.

Bright-Line jest znakiem towarowym firmy Cambridge Instruments, Inc.
Nalgene jest zastrzeżonym znakiem towarowym firmy Thermo Fisher Scientific lub jej spółek zależnych