Liczenie komórek przy użyciu hemocytometru

W przypadku większości manipulacji przy użyciu linii komórkowych, takich jak transfekcje, techniki fuzji komórek, kriokonserwacja i procedury podhodowli, konieczne jest ilościowe określenie liczby komórek przed ich użyciem. Użycie stałej liczby komórek pozwoli utrzymać optymalny wzrost, a także pomoże w standaryzacji procedur wykorzystujących hodowle komórkowe. To z kolei daje wyniki o lepszej powtarzalności.

Czytaj więcej

• Materiały
• Sprzęt
• Sprzęt
• Procedura
• Kluczowe punkty

Materials

• Podłoże do hodowli komórkowej: wstępnie ogrzane do odpowiedniej temperatury (patrz arkusz danych linii komórkowej ECACC dla właściwej pożywki i temperatury).)
• 70% (v/v) alkohol w sterylnej wodzie (793213)
• Roztwór błękitu trypanu (T8154)
• 0.05% trypsyna/EDTA w HBSS, bez Ca²⁺/Mg²⁺ (T3924)

Equipment

• Środki ochrony osobistej (sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny, przyłbica ochronna)
• Łaźnia wodna ustawiona na odpowiednią temperaturę
• Szafa mikrobiologiczna na odpowiednim poziomie hermetyczności
• Wirówka
• Inkubator CO2₂
• Hemocytometr
• Inwersyjny mikroskop z kontrastem fazowym
• Znakowane kolby

Procedura

1. Zawiesić przylegające i półprzylegające komórki przy użyciu trypsyny/EDTA zgodnie z wcześniejszym opisem i ponownie zawiesić w objętości świeżej pożywki co najmniej równej objętości trypsyny. W przypadku komórek, które rosną w grudkach, odwirować i ponownie zawiesić w małej objętości i delikatnie pipetować, aby rozbić grudki.
2. W sterylnych warunkach usunąć 100-200 μL zawiesiny komórek.
3. Dodaj taką samą objętość błękitu trypanu (współczynnik rozcieńczenia = 2) i wymieszaj przez delikatne pipetowanie.
4. Wyczyść hemocytometr.
5. Zwilż szkiełko nakrywkowe wodą lub wydychanym powietrzem. Przesuwaj szkiełko nakrywkowe nad komorą tam i z powrotem, lekko naciskając, aż pojawią się pierścienie załamania Newtona (pierścienie załamania Newtona są widoczne jako tęczowe pierścienie pod szkiełkiem nakrywkowym).
6. Wypełnij obie strony komory zawiesiną komórek (około 5-10 μL) i obejrzyj pod odwróconym mikroskopem z kontrastem fazowym przy powiększeniu x20.
7. Zlicz liczbę żywotnych (widocznych jako jasne komórki) i nieżywotnych komórek (zabarwionych na niebiesko). Idealnie byłoby policzyć 100 komórek w celu zwiększenia dokładności zliczania komórek (patrz uwagi poniżej). Zanotuj liczbę zliczonych kwadratów, aby uzyskać liczbę 100.
8. Oblicz stężenie żywych i nieżywotnych komórek oraz procent żywych komórek za pomocą poniższych równań.

Rysunek 1. Wzory do obliczania liczby komórek żywotnych, liczby komórek nieżywotnych i procentowej żywotności komórek na mililitr.

Kluczowe punkty

1. Błękit trypanu jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Należy nosić odzież ochronną, rękawice i ochronę twarzy/oczu. Nie wdychać oparów.

2. Centralny obszar komory zliczeniowej wynosi 1 mm². Obszar ten jest podzielony na 25 mniejszych kwadratów (1/25 mm²). Każdy z nich jest otoczony potrójnymi liniami, a następnie jest dalej podzielony na 16 (1/400 mm²). Głębokość komory wynosi 0,1 mm.

3. Współczynnik korekcji 10⁴ konwertuje 0.1 mm³ na 1 ml (0,1 mm³ = 1 mm² x 0,1 mm)

4. Istnieje kilka źródeł niedokładności:

•  Obecność pęcherzyków powietrza i zanieczyszczeń w komorze
• Przepełnienie komory w taki sposób, że próbka spływa do kanałów lub drugiej komory<
•  Niepełne wypełnienie komory Komórki nie są równomiernie rozmieszczone w komorze
•  Zbyt mała liczba komórek do zliczenia. Można temu zaradzić przez odwirowanie komórek, ponowne zawieszenie w mniejszej objętości i ponowne policzenie
•  Zbyt wiele komórek do policzenia. Można temu zaradzić, stosując wyższy współczynnik rozcieńczenia błękitu trypanu, np. 1:10

5. Użycie hemocytometru może być czasochłonne, podatne na subiektywne oceny operatora, a niektóre typy komórek, takie jak te, które tworzą skupiska, są szczególnie trudne do policzenia przy użyciu tej metody. Dostępny jest sprzęt do liczenia komórek oferujący alternatywne metody kwantyfikacji komórek, w tym licznik komórek Scepter™. Analizator komórek Muse^® umożliwia ocenę liczby i żywotności komórek w oparciu o cytometrię przepływową. Licznik komórek Scepter™ to przenośny, ręczny licznik komórek, który mierzy objętość przy użyciu zasady Coultera. Może on określać ilościowo komórki na podstawie ich wielkości i odróżniać większe komórki od mniejszych szczątków, w przeciwieństwie do technik opartych na wizji, które opierają się na oprogramowaniu do rozpoznawania obiektów i nie mogą niezawodnie wykrywać małych komórek. Licznik komórek Scepter™ wykrywa każdą komórkę i wyświetla populację jako histogram rozkładu wielkości komórek. Na podstawie histogramu można policzyć wszystkie komórki lub użyć funkcji bramkowania, aby policzyć wybraną subpopulację. Monitorując zmiany w histogramie, można uzyskać wgląd w zdrowie i jakość hodowli komórkowej od jednego eksperymentu do następnego.

Rysunek 2. Liczenie komórek przy użyciu hemocytometru i błękitu trypanu. Żywe komórki zawierają nienaruszone błony komórkowe i nie pobierają błękitu trypanu, a ich obraz w hemocytometrze jest jasny/przezroczysty. Martwe komórki mają uszkodzone błony komórkowe i pobierają błękit trypanu, pojawiając się na niebiesko w hemocytometrze. Żywotność komórek można oszacować na podstawie stosunku komórek żywych do martwych.