Wykrywanie, zapobieganie i eliminacja mykoplazm w hodowli komórkowej

Przeczytaj o

• Niewidzialne zagrożenie dla linii komórkowych i kultur
• Wspólne źródła Mycoplasma i jak je kontrolować
• Metody wykrywania Mycoplasma
• Metody usuwania mykoplazmy
• Rozwiązania do usuwania mykoplazmy
• Powiązane produkty

NIEWIDOCZNE ZAGROŻENIE ZANIECZYSZCZENIEM LINII I KULTUR KOMÓRKOWYCH

Utrzymanie kultur wolnych od zanieczyszczeń ma fundamentalne znaczenie dla badań opartych na komórkach. Jednym z najbardziej rozpowszechnionych zanieczyszczeń w kulturach komórek eukariotycznych i macierzystych jest mykoplazma. Członkowie tego rodzaju bakterii mają zazwyczaj rozmiar poniżej mikrona i nie posiadają ściany komórkowej. Sprawia to, że są one trudne lub niemożliwe do wykrycia pod mikroskopem i odporne na wiele antybiotyków.

Chociaż zanieczyszczenie mykoplazmą zwykle nie powoduje śmierci komórek, może powodować różne skutki dla hodowanych komórek. Obejmują one zmieniony metabolizm, spowolnione tempo wzrostu i aberracje chromosomalne. Takie zmiany mogą nie być natychmiast zauważalne, ale mogą ostatecznie wpłynąć na wiarygodność danych dotyczących hodowli. Zanieczyszczone linie komórkowe mogą być tak zagrożone, że zachowują się jak zupełnie inna linia.

Krótko mówiąc, zanieczyszczenie mykoplazmą zagraża ważności dotkniętych linii komórkowych w dostarczaniu znaczących danych do badań w dziedzinie nauk przyrodniczych.

POWSZECHNE ŹRÓDŁA MYCOPLASMA W LABORATORIUM I SPOSOBY ICH KONTROLI

Źródła skażenia mykoplazmą w laboratorium są bardzo trudne do kontrolowania. Ponieważ kilka gatunków występuje na ludzkiej skórze, mogą one zostać wprowadzone do hodowli poprzez niewłaściwą technikę aseptyczną.

Bakterie te mogą również zostać wprowadzone poprzez zanieczyszczone suplementy, takie jak płodowa surowica bydlęca, lub poprzez przeniesienie z innych zanieczyszczonych hodowli komórkowych. To zanieczyszczenie krzyżowe jest bardzo częstym sposobem wprowadzania zanieczyszczeń mykoplazmą w laboratorium. Ze względu na ich mały rozmiar (0,2-0,8 µm) i odkształcalność, mykoplazma może przenikać przez filtry o wielkości porów zaledwie 0,2 µm podczas sterylnej filtracji mediów. Mykoplazma może również szybko rozprzestrzeniać się, zanieczyszczając inne obszary laboratorium poprzez aerozole i cząstki stałe generowane podczas przenoszenia hodowli. 

Ścisłe przestrzeganie dobrych praktyk laboratoryjnych, takich jak sumienna technika aseptyczna, jest kluczowe. Rutynowe badania przesiewowe kultur są również wysoce zalecane w celu skutecznej kontroli zanieczyszczeń. Aby uzyskać więcej informacji na temat innych źródeł kontaminacji i sposobów zapobiegania kontaminacji, przeczytaj nasz artykuł na rozwiązywanie problemów z zanieczyszczeniem komórek.

Użycie sterylizujących filtrów o średnicy 0,1 µm może pomóc w usunięciu lub zmniejszeniu ilości mykoplazmy podczas przygotowywania pożywek, buforów i odczynników do hodowli komórkowych. Odkażające spraye i chusteczki przeznaczone do sprzętu laboratoryjnego i powierzchni mogą zapewnić dodatkową ochronę przed zanieczyszczeniem, jednocześnie zwiększając dokładność wyników badań przesiewowych PCR.

METODY WYKRYWANIA MYCOPLASMA

Poniższe produkty stanowią kompletny zestaw narzędzi do wykrywania mykoplazmy. Badacze mogą chcieć użyć drugiego testu, aby potwierdzić pozytywny wynik zanieczyszczenia mykoplazmą. Zestawy Multitest mogą również zapewnić, że testy są przeprowadzane z wystarczającą częstotliwością, aby chronić ważne kultury. Trzy skuteczne metody wykrywania to:

• Kultura mykoplazmy: pożywki bakteryjne zoptymalizowane pod kątem mykoplazmy są zaszczepiane próbkami testowymi i hodowane na płytce agarowej z mykoplazmą. Jest to najbardziej bezpośredni test na skażenie mykoplazmą, ale zajmuje też najwięcej czasu. Hodowle powinny być inkubowane przez co najmniej dwa tygodnie przed oceną, a uzyskanie wyników z hodowli mykoplazmy może potrwać do miesiąca.
• Metoda barwienia DNA:  Ta prosta metoda polega na barwieniu jąder bakterii za pomocą Hoechst lub DAPI, które są widoczne pod mikroskopem fluorescencyjnym. Chociaż szybka, metoda ta nie jest ostateczna dla zanieczyszczenia mykoplazmą.
• PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy): która będzie amplifikować bakteryjne DNA, jeśli jest ono obecne w próbkach kultury. Wykrywanie mykoplazmy w oparciu o PCR stało się zaufaną metodą rutynowej konserwacji hodowli komórkowych i jest metodą stosowaną przez firmy oferujące usługi wykrywania mykoplazmy, a także sposób, w jaki repozytoria komórek chronią swoje własne zapasy. Dobrze zaprojektowane startery PCR są ważne, aby wyeliminować fałszywie pozytywne wyniki i zapewnić, że cenne kultury nie zostaną zniszczone, jeśli nie są zanieczyszczone. Test ten można również wykonać szybko, co czyni go pomocnym w sytuacji potencjalnego wybuchu epidemii.

Testy PCR są niezwykle czułe i mogą zapewnić szybkie wyniki, umożliwiając badaczom szybką reakcję w celu wyizolowania i wyeliminowania skażenia mykoplazmą po jej wykryciu. Zestawy LookOut^® Mycoplasma PCR Detection Kits są wyjątkowo czułe, z granicą wykrywalności wynoszącą zaledwie 2 genomy na μL próbki. Nasz najnowszy jednoetapowy zestaw PCR został zaprojektowany tak, aby ograniczyć pipetowanie do minimum, ponieważ mieszanina PCR zawiera wszystkie odczynniki wymagane do reakcji: startery, nukleotydy, polimerazę i wewnętrzną kontrolę amplifikacji, dostarczone w gotowej do użycia liofilizowanej mieszaninie reakcyjnej. Zobacz naszą metodę Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma.

Zanieczyszczenie DNA może wpływać na wyniki testu PCR mykoplazmy. Eliminacja zanieczyszczającego DNA ze środowiska PCR jest zatem ważna dla zapewnienia dokładności testów PCR. Spray eliminujący DNA (L8917) i chusteczki (L9060-50) usuwają zanieczyszczenia kwasem nukleinowym ze środowiska PCR, prowadząc do dokładniejszych wyników PCR.

Metody usuwania mykoplazmy

Skuteczne strategie filtracji są niezbędne do zapobiegania zanieczyszczeniu mykoplazmą. Ze względu na swój niewielki rozmiar i odkształcalność, mykoplazmy mogą przenikać przez filtry o wielkości porów zaledwie 0,2 µm. Wykazano, że Filtry Stericup^® i Steritop^® zawierające membrany PES 0.1 µm PES mogą być skutecznie stosowane do redukcji mykoplazmy podczas przygotowywania pożywek i buforów do hodowli komórkowych. Wydajność wskazuje, że filtry te mogą być stosowane w celu zmniejszenia ryzyka zanieczyszczenia mykoplazmą w procesach hodowli komórkowej. Stosując strategie mikrofiltracji w procesach hodowli komórkowej, naukowcy mogą zmniejszyć ryzyko związane z zanieczyszczeniem mykoplazmą i zapewnić integralność i jakość swoich materiałów biologicznych.

ROZWIĄZANIA DO ELIMINACJI MYCOPLASMA

Po wykryciu mykoplazmy, hodowcy komórek mogą albo wyeliminować zanieczyszczenie z hodowli, albo zacząć od nowa. Często naukowcy chcą wyeliminować zanieczyszczenie, ponieważ linie komórkowe są ważne dla projektu lub drogie.

Nasze zestawy do eliminacji mykoplazmy są wygodnym i skutecznym wyborem do pozbycia się zanieczyszczeń z hodowli komórkowych.

PRODUKTY DO WYKRYWANIA, ZAPOBIEGANIA I ELIMINACJI ZANIECZYSZCZENIA MYCOPLASMĄ