Testy apoptozy
Testy komórkowe do wykrywania apoptozy
Apoptoza, czyli zaprogramowana śmierć komórki, to ograniczający wzrost mechanizm regulacyjny, dzięki któremu komórki mogą wywołać własną śmierć w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe z powodu nieodwracalnego uszkodzenia komórek lub DNA. Zdolność komórek nowotworowych do unikania apoptozy jest cechą charakterystyczną większości rodzajów raka. Apoptoza odgrywa również ważną rolę w mechanizmach rozwojowych, takich jak zapobieganie przerostowi linii komórek neuronalnych w rozwijającym się mózgu i regulowanie odstępów międzypalcowych w rozwoju kończyn.Autofagia i apoptoza są ze sobą powiązane i zachodzi między nimi rozległy przesłuch. Na przykład podczas niedoboru składników odżywczych autofagia działa jako mechanizm pro-przetrwania. Jednak nadmierna autofagia może prowadzić do śmierci komórki, procesu morfologicznie odmiennego od apoptozy. Apoptoza jest wieloetapowym procesem obejmującym wczesne, środkowe i późne etapy zdarzeń komórkowych, które można wykryć za pomocą różnych testów komórkowych, w tym metod wykrywania aneksyny V, kaspazy i TUNEL opisanych poniżej.
Etapy apoptozy
Zdarzenia wczesnego etapu: Translokacja fosfatydyloseryny do zewnętrznego liścia błony plazmatycznej (1), utrata potencjału błony mitochondrialnej (2), cytochrom C & uwalnianie ATP (3) i aktywacja kaspazy-8 i 9 (4).
Mid-Stage Events: Aktywacja kaspazy-3, 6 i 7 (5), rozszczepienie polimerazy poli-ADP-rybozy (PARP) (6), kurczenie się komórek (7) i aktywacja nukleaz (8).
Zdarzenia późnego etapu: Fragmentacja DNA (9), zapaść jądrowa (10), tworzenie ciał apoptotycznych (11) i fagocytoza przez makrofagi (12).
Early-Stage Apoptosis
Annexin V Assays: Fosfatydyloseryna jest normalnie zamknięta w wewnętrznej ulotce błony żywych komórek. Przeniesienie fosfatydyloseryny na odsłoniętą powierzchnię błony jest wczesnym wydarzeniem w apoptozie, gdzie służy jako sygnał do ataku komórek fagocytarnych. Aneksyny to rodzina strukturalnie powiązanych białek, które mogą wiązać się specyficznie z błonami komórkowymi. Aneksyna V ma bardzo wysokie powinowactwo do błon zawierających ujemnie naładowaną fosfolipidową fosfatydyloserynę i może być stosowana jako marker wczesnych zdarzeń apoptozy.
Rysunek 1.Wykresy punktowe przedstawiające komórki Jurkat traktowane różnymi stężeniami induktorów apoptozy i barwione przy użyciu zestawu Annexin Red Kit (FCCH100108). Komórki Jurkat były nieleczone (wykres A) lub traktowane 0,1 uM (wykres B) lub 3 uM Staurosporyną (wykres C), a następnie barwione przy użyciu zestawu FlowCelllect Annexin Red Kit.
Wykrywanie mitochondriów: Mitochondria są ważnymi organellami komórkowymi, które utrzymują kluczową równowagę energetyczną komórek, zawierają kluczowe regulatory procesów śmierci komórkowej, takich jak apoptoza i odgrywają znaczącą rolę w generowaniu stresu oksydacyjnego w komórkach. Uważa się, że załamanie potencjału błony mitochondrialnej zbiega się z permeabilizacją zewnętrznej błony mitochondrialnej i uwolnieniem cytochromu C i innych białek proapoptotycznych do cytozolu, co następnie wyzwala dalsze zdarzenia w kaskadzie apoptotycznej.
Apoptoza na średnim etapie
Testy wykrywania kaspaz: Centralnym składnikiem procesu apoptozy jest kaskada enzymów proteolitycznych zwanych kaspazami. Kaspazy uczestniczą w serii reakcji, które są wyzwalane w odpowiedzi na sygnały proapoptotyczne i powodują rozszczepienie substratów białkowych, powodując rozpad komórki. Enzymy kaspazowe specyficznie rozpoznają sekwencję 4 lub 5 aminokwasów na docelowym substracie, który koniecznie zawiera resztę kwasu asparaginowego. Reszta ta jest celem rozszczepienia, które zachodzi na karbonylowym końcu reszty kwasu asparaginowego.
Obrazowanie na żywo apoptozy w komórkach odpornościowych przy użyciu systemu mikroprzepływowego CellASIC® ONIX2
Rysunek 2. Wykrywanie na żywo potencjału błony mitochondrialnej, aktywności kaspaz i apoptozy w komórkach raka piersi MCF-7.Nietraktowane komórki MCF-7 (86012803) (A) lub traktowane staurosporyną (S5921) przez noc w celu wywołania apoptozy (B), a następnie barwione barwnikiem BioTracker™ 405 Blue Mitochondria Dye (SCT135), BioTracker NucView® 530 Red Caspase-3 Dye (SCT105) i CF®488A Annexin V przez 30 minut w temperaturze 37°C w pożywce do hodowli komórek bez płukania. Zdrowe komórki wykazują zabarwienie mitochondriów (cyjan), komórki apoptotyczne tracą niebieskie zabarwienie (cyjan) i wykazują zwiększone zabarwienie jąder komórkowych (czerwony) oraz zabarwienie CF®488A Aneksyną V błon komórkowych (zielony).
Późny etap apoptozy
TUNEL Assays: Fragmentacja DNA w apoptozie jest zwykle związana ze zmianami strukturalnymi w morfologii komórkowej i jest cechą charakterystyczną późnego etapu apoptozy. Fragmentację DNA w apoptozie można zbadać za pomocą testu TUNEL. Barwienie in situ pęknięć nici DNA wykrytych w teście TUNEL i późniejsza wizualizacja za pomocą mikroskopii świetlnej dostarcza biologicznie istotnych danych na temat uszkodzeń DNA i późnego etapu apoptozy.
Rysunek 3.Rodzina zestawów do apoptozy ApopTag™ bada fragmentację DNA za pomocą testu TUNEL. Pęknięcia nici DNA są wykrywane poprzez enzymatyczne znakowanie wolnych końców 3'-OH zmodyfikowanymi nukleotydami. Te nowe końce DNA, które powstają podczas fragmentacji DNA, są zwykle zlokalizowane w morfologicznie identyfikowalnych jądrach i ciałach apoptotycznych.
Rysunek 4.A) Wykrywanie komórek apoptotycznych w ludzkim węźle chłonnym za pomocą peroksydazy ApopTag® (S7200). Tkankę utrwalono w 10% buforowanej obojętnie formalinie i zatopiono w parafinie. B) Wykrywanie komórek apoptotycznych za pomocą zestawu ApopTag® Fluorescein Direct (S7160) w zarodkowym pąku kończyny przedniej myszy, utrwalonym 10% buforowaną formaliną i zatopionym w parafinie. C) Wykrywanie komórek apoptotycznych za pomocą ApopTag® Red (S7165) w tkance ludzkiego węzła chłonnego, utrwalonej 10% buforowaną obojętnie formaliną i zatopionej w parafinie.
H2A.X Assays: Generowane są dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB), które szybko powodują fosforylację wariantu histonu H2A.X. Ponieważ fosforylacja H2A.X przy Ser139 dobrze koreluje z każdym DSB, fosfo-H2A.X jest czułym markerem używanym do badania uszkodzeń DNA i późnego etapu apoptozy.
Wnioski
Programowana śmierć komórki (apoptoza) jest kontrolowana przez wiele szlaków sygnałowych i efektorowych związanych z depolaryzacją mitochondriów, kaskadami enzymów apoptotycznych związanych z kaspazami, fragmentacją DNA i ostatecznie rozerwaniem i zniszczeniem komórki. Integralność tych i innych powiązań może być genetycznie zagrożona w wielu chorobach, takich jak rak, co sprawia, że wykrywanie i pomiar apoptozy jest niezwykle przydatny w wielu testach badawczych. Nasze dobrze opublikowane testy apoptozy, w tym rodzina testów TUNEL ApopTag® i rodzina testów CaspaTag™ do wykrywania kaspaz in situ, umożliwiają powtarzalny wgląd w mechanizmy śmierci komórkowej.
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?