Różnicowanie ludzkich komórek iPS w organoidy nabłonka dróg oddechowych na potrzeby badań nad chorobami układu oddechowego In Vitro

Min Lu, Kevin Su, Nick Asbrock, Vi Chu

• Protokół różnicowania organoidów płuc
• Przewodnik rozwiązywania problemów z organoidami nabłonka dróg oddechowych

Organy płucne są użytecznymi trójwymiarowymi (3D) modelami hodowli komórkowych do badania rozwoju ludzkich płuc i chorób układu oddechowego, w tym infekcji wirusowych (SARS-CoV, H1N1, MERS), mukowiscydozy, astmy/COPD, narażenia na zanieczyszczenie powietrza i skutków palenia tytoniu. W przeciwieństwie do tradycyjnych unieśmiertelnionych linii komórek płucnych i komórek pierwotnych, organoidy płucne zawierają różne zróżnicowane typy komórek o złożonej architekturze tkankowej, które bardziej przypominają in vivo tkanki i funkcjonalność. Dodatkowo, organoidy płucne mogą być uzyskiwane z niewielkich ilości tkanek pacjenta lub pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu stworzenia żywych biobanków, które ułatwiają spersonalizowane badania biomedyczne.

Ludzki system hodowli organoidów płuc 3dGRO™ to pozbawiony surowicy, wieloetapowy system hodowli do skutecznego różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS) do dojrzałych organoidów płuc, które strukturalnie przypominają rozgałęzione drogi oddechowe i wczesne struktury pęcherzyków płucnych. Wykorzystując system hodowli ludzkich organoidów płuc 3dGRO™, można wygenerować dużą liczbę dojrzałych organoidów płuc, które wyrażają odpowiednie markery wskazujące na wiele typów komórek występujących w dojrzałych płucach i drogach oddechowych, w tym SFTPB i SFTPC (białko surfaktantu B i białko surfaktantu C) występujące w komórkach nabłonka pęcherzyków płucnych typu II (ATII), MUC5AC (komórki kubkowe dróg oddechowych), EpCAM, Sox9 i Nkx2.1 (endoderma płucna), acetylo-α-tubulina (komórki rzęskowe) i marker mezenchymalny wimentyna. Ponadto organoidy płucne wyrażają również enzym konwertujący angiotensynę 2 (ACE2), receptor dla nowego wirusa SARS-CoV-2, który powoduje COVID-19, wraz z TMPRSS2, proteazą serynową, która zwiększa wnikanie wirusa SARS-CoV-2.

Rysunek 1. Proces różnicowania organoidów ludzkich płuc. Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste są różnicowane w ostateczne komórki endodermy przy użyciu 4-dniowej pożywki indukcyjnej. W dniach 4-8 pożywka indukcyjna (SCM305, SCM306) kieruje ludzkie ostateczne komórki endodermy w stronę endodermy przedniego odcinka jelita (AFE). Komórki AFE mogą być kriokonserwowane (SCC301) lub dalej różnicowane w rozgałęziające się organoidy pąków płucnych przy użyciu 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) i dalej dojrzewać w rozgałęziające się i pęcherzykowe organoidy płucne przy użyciu 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308).

Protokół różnicowania organoidów płuc

Krok 1: Różnicowanie ludzkich komórek iPS w endodermę ostateczną (dzień 0-4)

Uwaga: Zacznij od wysokiej jakości niezróżnicowanych ludzkich komórek ES/iPS (SCC271), które są ~70-80% konfluentne i zawierają <5% zróżnicowanych komórek. Poniższy protokół dotyczy różnicowania jednej studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej. Wskazane objętości dotyczą pojedynczego dołka.

1. Przygotuj pożywkę do pasażowania pojedynczych komórek. Dodaj inhibitor ROCK (ROCKi) Y-27632 (SCM075) do 7-10 ml pożywki do ekspansji ludzkich komórek ES/iPS (SCM130) do końcowego stężenia 10 µM.
2. Pokryj 6-dołkową płytkę żelem ECM (CC131).
3. Zasysaj pożywkę. Przemyć studzienkę 2 ml DMEM/F12 lub 1X PBS. Odessać i dodać 1 ml roztworu Accumax™ (A7089) do dołka. Inkubować przez 5-6 minut w temperaturze 37°C. Uderz mocno płytką o dłoń, aby pomóc usunąć komórki.
4. Dodaj 1 ml pożywki do pasażowania pojedynczych komórek (z kroku 1) do dołka. Pipetuj w górę i w dół 1-3 razy pipetorem o pojemności 5 ml, aby usunąć komórki. Uważaj, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.
5. Zbierz zdysocjowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj 1 ml pożywki do pasażowania pojedynczych komórek do studzienki i zbierz pozostałe komórki w celu przeniesienia ich do 15 ml probówki stożkowej zawierającej zawiesinę komórek. Wirować probówkę przy 140 x g przez 5 minut i odessać supernatant.
6. Zawiesić ponownie osad komórkowy w 1 ml podłoża do pasażowania pojedynczych komórek.  Policzyć całkowitą liczbę żywych komórek za pomocą automatycznego licznika komórek lub błękitu Trypana (T8154) i hemocytometru.
7. Dodaj 1x10⁶ komórek na studzienkę do 6-dołkowej płytki pokrytej żelem ECM (CC131). Należy użyć pożywki do pasażowania pojedynczych komórek (z kroku 1). Całkowita objętość = 3 ml na dołek. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc.
8. Odessać pożywkę z dołka. Dodaj 2 ml Definitive Endoderm Induction Medium (SCM302) do studzienki i inkubuj w temperaturze 37°C przez noc.
9. Powtórz krok 8 dla dnia 2 i dnia 3. Analizuj komórki za pomocą cytometrii przepływowej w dniu 4. Przed przejściem do kroku 2, komórki powinny być w 80% pozytywne dla markerów endodermy CXCR4, c-Kit, Sox-17 i FOXA2 oraz negatywne dla PDGFR.

Krok 2: Różnicowanie komórek DE do komórek endodermy przedniego odcinka przewodu pokarmowego (dzień 4-8)

Uwaga: Wysoką gęstość komórek należy obserwować zarówno w 4. dniu definitywnej endodermy, jak i w 8. dniu po różnicowaniu do komórek endodermy przedniego odcinka przewodu pokarmowego (AFE). Poniższy protokół zapewnia referencyjną gęstość wysiewu w formacie płytki 6-dołkowej. Dostosuj gęstość wysiewu dla innych formatów płytek.

1. Wyjmij z inkubatora 6-dołkową płytkę zawierającą hodowle endodermy ostatecznej w 4. dniu.
2. Zasysaj pożywkę z każdej studzienki. Przemyć każdą studzienkę 2 ml 1X PBS (BSS-1006-B).
3. Dodaj 1 ml roztworu Accumax™ (A7089) na studzienkę w celu dysocjacji komórek endodermy ostatecznej. Inkubować w temperaturze 37°C przez 6-8 minut.
4. Po 5 minutach sprawdź wzrokowo płytkę. Delikatnie uderz w krawędź płytki, aby jeszcze bardziej oddzielić komórki. Większość komórek powinna oddzielić się jako zawiesina. Jeśli nie, inkubuj jeszcze 2 minuty.
5. Dodaj 2 ml 1X PBS (BSS-1006-B) na studzienkę, aby rozcieńczyć roztwór AccuMax™ (A7089). Przenieś zawiesinę komórek do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Przepłukać każdą studzienkę 1 ml 1X PBS, aby zebrać wszelkie pozostałe komórki i dodać je do 50 ml probówki stożkowej. Pipetować kilka razy w górę i w dół, aby uzyskać pojedynczą zawiesinę komórek.
6. Wirować zawiesinę komórek z prędkością 130 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Odwirować supernatant. Zawiesić osad komórek w 2 ml AFE Induction Medium I (SCM305).  Policzyć komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru.
   Pokryj 6-dołkowe płytki fibronektyną (F0895) w stężeniu 4 µg/ml w PBS. Dodać 1,5 ml rozcieńczonej fibronektyny na studzienkę. Przechowywać powleczone naczynia przez noc w temperaturze 2-8 °C. Odessać roztwór powlekający. Suszyć na powietrzu pod przykryciem przez 5 minut. Gdy płytki wyschną, przykryj je pokrywką i odstaw na bok, aż komórki będą gotowe.
8. Nałóż 1X10⁶  komórek na studzienkę na 6-dołkowe płytki pokryte fibronektyną. Dodaj odpowiednią objętość AFE Induction Medium I (SCM305) do każdej studzienki, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml na studzienkę.
9. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Delikatnie poruszaj płytką z boku na bok oraz do przodu i do tyłu, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na powierzchni dołka. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
10. Dzień 5:  Zastąpić 2 ml na studzienkę AFE Induction Medium II (SCM306). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
11. Dzień 6:  Zastąpić podłoże 2 ml na studzienkę pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307).Inkubować w temperaturze 37 °C przez 24 godziny.
12. Dzień 7:  Zastąpić podłoże 2 ml na studzienkę pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307). Inkubować w temperaturze 37°C przez 24 godziny.
13. Dzień 8: Komórki AFE powinny wykazywać zmiany morfologiczne obejmujące zlewające się obszary przeplatane skupiskami/agregatami komórek. Postępuj zgodnie z protokołem, aby dalej różnicować się w dojrzałe organoidy płucne. Nadmiar komórek AFE można poddać kriokonserwacji przy użyciu pożywki 3dGRO™ Organoid Freeze Medium (SCM301) w ilości 3-6 x 10⁶ komórek na fiolkę.

.

Rysunek 2. Ekspresja markerów endodermy przedniego odcinka jelita (AFE). Około 95-100% komórek AFE jest podwójnie dodatnich dla Sox2 (A, C, AB5603A4) i Pax9 (B, C). Około 20-30% komórek AFE jest podwójnie dodatnich dla EpCAM (D, F, MAB4444) i Pax9 (E, F).

Krok 3: Różnicowanie komórek AFE w organoidy pączków płucnych (dzień 8-25)

1. Zasysaj i dodaj 1 ml świeżej pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) do każdej studzienki 6-dołkowej płytki zawierającej konfluentną warstwę komórek AFE.
2. Używając pipety o pojemności 5 ml, delikatnie zeskrob powierzchnię każdej studzienki, aby usunąć monowarstwę komórek w postaci agregatów. Należy uważać, aby nie rozcierać pojedynczych komórek. Przenieś agregaty komórek z 1 dołka 6-dołkowej płytki do dołka 24-dołkowej płytki Costar^® Ultra-Low Attachment (CLS3473).
3. Dodaj 0,5 ml pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307), aby zebrać wszelkie pozostałe komórki i dodaj do studzienki z komórkami w 24-dołkowej płytce o niskiej przyczepności. Całkowita objętość = ~ 1,5 ml zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 37°C.
4. Wymieniać pożywkę co drugi dzień do 20-25 dnia. Ponieważ organoidy znajdują się w kulturze pływającej, użyj następującego protokołu do wymiany mediów:
   1. Użyj szklanej pipety serologicznej o pojemności 1 ml, aby przenieść pływające organoidy do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odczekaj 10 minut, aż organoidy opadną na dno probówki.
   2. Podłącz pipetę zasysającą 2 ml do pompy próżniowej. Do pipety aspiracyjnej o pojemności 2 ml przymocuj sterylną końcówkę pipety bez bariery o pojemności 20 µL. Ostrożnie odessać pożywkę. Uważaj, aby pozostawić niewielką objętość pożywki nad organoidami jako bufor, aby uniknąć zakłócenia organoidów.
   3. Dodaj 0,5 ml pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) do 15 ml probówki zawierającej osad organoidów. Dwukrotnie przeprowadź pipetowanie w górę i w dół za pomocą szklanej pipety o pojemności 1 ml. Przenieś organoidy z powrotem do tej samej studzienki w 24-dołkowej płytce o ultra niskim poziomie mocowania.
   4. Dodaj 0,5 ml 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) do 15 ml probówki stożkowej, aby przepłukać i zebrać wszelkie pozostałe organoidy. Dodaj popłuczyny do tej samej studzienki na 24-dołkowej płytce o ultra niskim poziomie mocowania. Całkowita objętość = 1 ml na studzienkę.

Rysunek 3. Ludzkie organoidy pączków płucnych (LBO) w hodowlach zawiesinowych. Morfologia niedojrzałych ludzkich LBO pochodzących z komórek iPS w 23 dniu różnicowania. Dolne panele pokazują optymalne organoidy ze złożonymi strukturami (strzałki), które mogą być wybrane do dalszego dojrzewania w kanapkach Matrigel® przy użyciu 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (krok 4).

Krok 4: Różnicowanie organoidów pączków płucnych (LBO) w dojrzałe organoidy płucne (dzień 25-60)

1. Obniżony czynnik wzrostu Matrigel^® matrix (Corning Cat. No. 354230) na lodzie.
2. Użyj sterylnych kleszczyków do przeniesienia sterylnych 24-dołkowych wkładek (Corning Cat. Nr kat. 353095) do 24-dołkowej płytki (Nr kat. 351147), używając jednej wkładki na studzienkę.
3. Nałóż 50 µl zimnego 100% Matrigelu o obniżonej zawartości czynnika wzrostu^® na każdą wkładkę. Odczekaj 5 minut, aż Matrigel^® matrix zestali się.
4. W międzyczasie przenieś jedną studzienkę z pływającymi organoidami pączków płucnych (LBO) do 60 mm szalki Petriego. W oddzielnej 96-dołkowej płytce z dnem w kształcie litery U dodaj 60 µl pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308) do każdej studzienki. 
   Uwaga: W dniach 20-25 będzie wiele pływających organoidów płucnych (Rysunek 3). Każda kanapka Matrigel^® powinna zawierać około 4-6 organoidów. Oblicz liczbę planowanych kanapek Matrigel^® w celu określenia całkowitej liczby dołków na płytce 96-dołkowej, które będą potrzebne do przygotowania zawiesiny organoidów/Matrigel^® .
5. W sterylnej osłonie sekcyjnej, użyj sterylnej końcówki pipety 20 µL ustawionej na objętość 10 µL, aby wybrać i przenieść 6 złożonych organoidów z 60 mm szalki hodowlanej do 1 studzienki 96-dołkowej płytki z U-dnem.
6. Przenieś 96-dołkową płytkę z wyciągu do dysekcji do wyciągu do hodowli tkankowej.
   Uwaga:Aby uniknąć przedwczesnego żelowania Matrigel^® matrycy, zalecamy przygotowanie nie więcej niż 3 wkładek na raz.
   1. Dodaj 60 µl zimnego 100% Matrigel^® Growth Factor Reduced (GFR) Matrigel^® matrix do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z kroku 5. Delikatnie wymieszać przez kilkukrotne pipetowanie, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Całkowita objętość = 130 µL na studzienkę.
   2. Natychmiast przenieś mieszaninę organoid-GFR Matrigel^® matrix (~130 µL) na środek każdej płytki w 24-dołkowej płytce przygotowanej w kroku 3.
   3. Odczekaj 5 minut, aż Matrigel^® matryca zestali się.
   4. Powtarzaj, aż przetworzonych zostanie łącznie 6 kanapek.
7. Dodaj 75 µl zimnego 100% Matrigel^® Matrigel o obniżonej zawartości czynnika wzrostu (GFR) do górnej części wkładów, aby utworzyć Matrigel^® kanapkę.Umieść 24-dołkowe płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C na co najmniej 30 minut, aby upewnić się, że Matrigel^® kanapki zestaliły się. Jeśli masz więcej niż 6 kanapek do osadzenia, powtórz kroki 4-7.
8. Dodaj 500 µL pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308) na wierzch każdej wkładki i  500 µL do studzienek pod wkładkami.
9. Wymieniaj pożywkę co drugi dzień. 
   1. Podłącz pipetę aspiracyjną o pojemności 2 ml do pompy próżniowej. Do pipety zasysającej o pojemności 2 ml przymocuj sterylną końcówkę pipety bez bariery o pojemności 20 µL. Ostrożnie odessać pożywkę na wierzch Matrigel^® kanapek, a także pod wkładki.
   2. Dodaj 500 µL pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308) na wierzch każdej wkładki i 500 µL do studzienek pod wkładkami.

.

Rysunek 4. Przebieg czasowy dojrzewania organoidów płuc. Śledzenie różnicowania organoidów płuc pochodzących z ludzkich komórek iPS w dwóch pojedynczych dołkach. W 20-25 dniu około 4-6 niedojrzałych LBO zostało osadzonych w matrycy Matrigel® przy użyciu 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium. Zaobserwowano różne morfologie, które obejmowały rozgałęzione struktury i/lub zaokrąglone rozszerzenia na końcach z gęstym materiałem w środku przypominającym pęcherzyki płucne. Gdy hodowla jest utrzymywana powyżej 60-70 dnia, niektóre duże zaokrąglone struktury mogą pęknąć, uwalniając materiał podobny do śluzu.

Rysunek 5. Ekspresja markerów organoidów płuc. Dojrzałe organoidy płucne pochodzące z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i ludzkich komórek iPS HFF wykazują ekspresję markerów komórek nabłonka pęcherzyków płucnych typu II produkujących surfaktant (SFTPC i SFTPB), komórek kubkowych dróg oddechowych (Muc5AC), endodermy płucnej (EPCAM, Sox9, NKX2.1) i komórek rzęskowych (acetylo-α-tubulina). Jądra są wybarwione DAPI.

Rysunek 6. Organoidy płucne mogą być wykorzystywane do badania infekcji wirusowych układu oddechowego SARS-CoV-2. Organoidy pączków płuc wyrażają ACE2, receptor wiążący SARS-CoV-2 (A) i proteazę serynową TMPRSS2 (B), która zwiększa wnikanie wirusa SARS-CoV-2.

Przewodnik rozwiązywania problemów z organoidami nabłonka dróg oddechowych

Problem 1: Po przeniesieniu organoidów pączków płucnych (LBO) w D20-25 do Matrigel^® kanapek, po dwóch tygodniach nie obserwuje się rozgałęzień ani struktur pęcherzykowych.

1. Podłoże 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) i 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308) zawierają składniki wrażliwe na temperaturę i światło.  Przygotuj podwielokrotności w oparciu o planowany eksperyment i unikaj wielokrotnego zamrażania/rozmrażania. Ważne jest, aby postępować zgodnie z instrukcjami zawartymi w sekcji "Przechowywanie i stabilność" w podręczniku. Rozmroź i użyj nowej porcji 3dGRO™ Lung Organoid Branching Medium (SCM307) i/lub 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308).
2. Wybierz LBO, które mają złożone struktury do przeniesienia w celu wykonania kanapek Matrigel^®. Patrz Rysunek 3&nbspw celu zapoznania się z przykładami LBO z pofałdowanymi strukturami.
3. Wysoka gęstość komórek powinna być obserwowana zarówno w dniu 4, jak i 8 przed rozpoczęciem pływającej hodowli zawiesinowej; dostosuj gęstość siewu w oparciu o typ komórek.

Problem 2: Pływające LBO przyczepiają się do dna płytki podczas hodowli zawiesinowej.

Używaj płytek 24-dołkowych o bardzo niskim poziomie przyczepności zamiast płytek 24-dołkowych poddanych hodowli tkankowej lub płytek Petriego.

Problem 3: Po zmianie pożywki dla kanapek Matrigel^® górna warstwa wydaje się miękka lub zapada się.

Dodaj 75 µl 100% Matrigel^® Matrix o obniżonej zawartości czynnika wzrostu (GFR) do górnej warstwy kanapki zamiast 50 µl. Umieść 24-dołkowe płytki w inkubatorze na ≥30 minut, aby upewnić się, że kanapki Matrigel^® zestaliły się.

Problem 4: Odsetek komórek c-kit⁺/CXCR4⁺ dodatnich wynosi poniżej 80% w dniu 4.

Kompaktowa populacja komórek c-kit⁺/CXCR4⁺ powinna być obserwowana w 4. dniu z dodatnimi komórkami na poziomie 80-90% lub wyższym. Nie zaleca się kontynuowania różnicowania bez udanej ostatecznej indukcji endodermy w dniu 4.

Problem 5: Podczas późniejszych etapów dojrzewania pożywka może szybko żółknąć.

W tym czasie osadzone organoidy mogą się powiększać, a niektóre mogą rozszerzać złożone procesy (Rysunek 5). Dodaj 750 µL pożywki 3dGRO™ Lung Organoid Maturation Medium (SCM308) do górnej części wkładek i 500 µL do studzienek pod wkładkami.

.

Produkty

Przepraszamy, wystąpił nieoczekiwany błąd

Network error: Failed to fetch