Protokół analizy ekspresji genów/liczby kopii qPCR z wykorzystaniem wykrywania barwnika SYBR Green I

PCR Technologies Protocols Table of Contents

Optymalizacja warunków qPCR

Optymalizacja warunków qPCR jest ważna dla opracowania solidnego testu. Oznaką słabej optymalizacji jest brak odtwarzalności między powtórzeniami, a także nieefektywne i niewrażliwe testy. Dwa główne podejścia to optymalizacja stężenia starterów i/lub temperatury annealingu. 

Pomiar ilości docelowej w stosunku do jednego lub więcej stabilnych genów referencyjnych przy użyciu wykrywania barwnika SYBR Green I jest powszechnym zastosowaniem qPCR. Poniżej znajduje się standardowy protokół, który można dostosować do konkretnych potrzeb eksperymentalnych.

Cele eksperymentalne

Po optymalizacji testów qPCR zarówno dla genów docelowych, jak i referencyjnych, są one wykorzystywane do pomiaru ilości celu. Stosunek jest określany między ilością genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI) a stabilnym genem referencyjnym (genami referencyjnymi), jak opisano w Analiza danych. W tym przykładzie do określenia liczby kopii używana jest krzywa standardowa. Jednakże, względna ilość może być również określona bez krzywej standardowej przy użyciu alternatywnej metody analizy Comparative Quantification (Data Analysis). W przypadku przyjęcia tego podejścia, krzywa standardowa jest pomijana, ale próbka kalibracyjna jest dołączana do wszystkich próbek testowych. Standardowe stężenia starterów i temperatury wyżarzania są zawarte w protokole, ale należy je dostosować na podstawie wyników eksperymentów optymalizacyjnych (Primer Concentration Optimization oraz Primer Optimization Using Temperature Gradient).

Sprzęt

• Urządzenie do ilościowego PCR 
• Kaptur z przepływem laminarnym do konfiguracji PCR (opcjonalnie)

Odczynniki

• gDNA 10ng do 100ng lub cDNA do użycia jako matryca (rozcieńczone 1:2 dla genów o niskiej ekspresji do 1:10 do 1:100 dla genów o średniej i wysokiej ekspresji).
• KiCqStart SYBR^® Green ReadyMix™ (KCQS00/KCQS01/KCQS02/KCQS03 - w zależności od urządzenia, patrz Tabela P4-6).
• Woda klasy PCR: Woda klasy PCR (W1754 lub W4502) jako 20 ml podwielokrotności; zamrozić; użyć świeżej podwielokrotności dla każdej reakcji.
• Startery do przodu i do tyłu dla badanych genów (zapas 10 μM).

Tabela P17-42. Przewodnik wyboru mieszanki SYBR Green PCR

Hot Start ReadyMixes (Taq, Buffer, dNTPs, Reference Dye, MgCl2)
KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™, Cat. Nr kat. KCQS00	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ Low Rox , Cat. Nr kat. KCQS01	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ z ROX, Cat. Nr kat. KCQS02	KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix™ for iQ, Cat. Nr kat. KCQS03
Kompatybilne urządzenia:	Kompatybilne instrumenty:	Kompatybilne instrumenty:	Kompatybilne instrumenty:
Bio-Rad CFX384™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 5700	Bio-Rad iCycler iQ™
Bio-Rad CFX96™	Applied Biosystems 7500	Applied Biosystems 7000	Bio-Rad iQ™5
Bio-Rad MiniOpticon™	Fast Applied Biosystems ViiA 7	Applied Biosystems 7300	Bio-Rad MyiQ™
Bio-Rad MyiQ™	Stratagene Mx3000P®	Applied Biosystems 7700
Bio-Rad/MJ Chromo4™	Stratagene Mx3005P™	Applied Biosystems 7900
Bio-Rad/MJ Opticon 2	Stratagene Mx4000™	Applied Biosystems 7900 HT Fast
Bio-Rad/MJ Opticon®		Applied Biosystems 7900HT
Cepheid SmartCycler®		Applied Biosystems StepOnePlus™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex		Applied Biosystems StepOne™
Eppendorf Mastercycler® ep realplex2 s
Illumina Eco qPCR
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 3000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® 6000
Qiagen/Corbett Rotor-Gene® Q
Roche LightCycler® 480

Dostawy

• Filtr sterylny końcówki do pipet
• Sterylne 1.5 ml zakręcane probówki do mikrowirówki (CLS430909)
• Probówki i płytki do PCR, wybierz jeden z nich, aby dopasować żądany format:
  -    Pojedyncze cienkościenne probówki PCR o pojemności 200 μL (Z374873 lub&P3114)
  -    Płytki
        - płytki 96-dołkowe (Z374903)
       - Płytki 384-dołkowe (Z374911)
  -    Uszczelki do płytek
       - Folie uszczelniające ThermalSeal RTS™ (Z734438)
        - Folia ThermalSeal RT2RR™ (Z722553)

Uwagi do tego protokołu

• cDNA jest generowane przy użyciu losowego primingu lub metody oligo-dT (Standardowy protokół odwrotnej transkrypcji (dwuetapowy)).
• Rozcieńczyć startery do przodu i do tyłu do 10 μM lub do odpowiedniego stężenia określonego w wyniku optymalizacji (Primer Concentration Optimization oraz Primer Optimization Using Temperature Gradient).
• Jeśli używasz płytki PCR, postępuj zgodnie ze schematem płytki, aby upewnić się, że mieszanina reakcyjna, próbki i kontrole są dodawane do właściwych studzienek.
• Wszystkie testy zostaną przeprowadzone jako zduplikowane reakcje.

Metoda

1.    Przygotuj inną mieszaninę wzorcową qPCR dla każdej pary starterów, która ma zostać uruchomiona. Przygotuj wystarczającą ilość mieszaniny dla próbek, wzorca
     reakcji krzywej (opisanych jako sześć rozcieńczeń poniżej), braku kontroli szablonów, wszystkie w duplikatach plus oblicz dodatkowe 10%, aby
    pozwolić na błąd pipetowania.

     Na przykład, jeśli jest pięć próbek testowych, przygotuj mieszaninę dla próbek (5×2) plus krzywa standardowa (6×2) plus brak szablonu
    Kontrola (NTC) (1×2) = 24 reakcje. Dlatego przygotuj mieszaninę dla 26,4 lub 27 reakcji na parę starterów.

Tabela P17-43. Mieszanina wzorcowa reakcji dla wykrywania SYBR Green I

Odczynniki	Objętość (μL) na pojedynczą 20 μL reakcję
2× KiCqStart SYBR Green qPCR ReadyMix	10
Prymer do przodu (10 μM)	0.9
Reverse primer (10 μM)	0.9
PCR grade water	3.2

2.    Przygotować 1:10-krotne (lub odpowiednie dla eksperymentu) seryjne rozcieńczenie odpowiedniego wzorca krzywej standardowej/cDNA tak
      aby w każdym rozcieńczeniu było 20 μL wzorca (łącznie sześć rozcieńczeń).

3.Dodaj 5 μL odpowiedniego seryjnego rozcieńczenia matrycy (krzywa standardowa), próbki testowego cDNA lub wody (NTC) do określonych
       probówek lub studzienek.

4.    Dodaj 15 μL mieszaniny wzorcowej do każdej probówki lub studzienki.

5.    Zakryj probówki lub uszczelnij płytkę PCR i opatrz etykietą. (Upewnij się, że etykiety nie zasłaniają ścieżki światła wzbudzenia/
     detekcji.)

6.    Przeprowadź próbki zgodnie z Tabelą P17-44.

 

.

Tabela P17-44. Warunki cyklu PCR dla generowania krzywej standardowej

Warunki cyklu	Temp (°C)	Czas (sek)
Denaturacja/gorący start	95	30
Kroki 1-2 są powtarzane przez 40 cykli
Krok 1	95	5
Krok 2	60	30

Uwaga: Użyj standardowego protokołu krzywej dysocjacji (zbieranie danych).