Rapid SYBR^® Green qPCR w systemie Illumina Eco^™ Real-Time PCR System

Szybka reakcja PCR w czasie rzeczywistym to wymagająca aplikacja, która wymaga spójnych i powtarzalnych wyników z trudnych amplikonów i reakcji o małej objętości.

Połączenie systemu Illumina Eco™ Real-Time PCR i zestawów KAPA SYBR^® FAST qPCR firmy Kapa Biosystems zapewnia wiodące w branży rozwiązanie do szybkiej reakcji PCR w czasie rzeczywistym o małej objętości bez uszczerbku dla wydajności, specyficzności i powtarzalności reakcji.

Wprowadzenie

Liczba aplikacji wykorzystujących PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) szybko rośnie. Zwiększona dokładność wyników w stosunku do końcowego PCR, możliwość multipleksowania, zmniejszone ryzyko zanieczyszczenia amplikonu i skrócony czas uzyskania wyników z testów qPCR w zamkniętych probówkach to czynniki przyczyniające się do wzrostu popularności PCR w czasie rzeczywistym. Typowe zastosowania qPCR obejmują: profilowanie ekspresji genów, genotypowanie, wykrywanie liczby kopii, walidację siRNA knockdown, testy miRNA, oznaczanie obciążenia bakteryjnego i wirusowego, ChIP qPCR oraz kwantyfikację biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Specyficzność i wydajność qPCR zależy od precyzyjnej kontroli temperatury podczas etapów denaturacji i wyżarzania. Aby uzyskać najwyższą dokładność, temperatura musi pozostać jednolita w całym bloku grzewczym, aby zapewnić, że wszystkie próbki są przetwarzane jednakowo. Standardowe protokoły cyklu qPCR oparte na SYBR^® Green I trwają od 1 godziny do 2 godzin, w zależności od szybkości rampy i czasu akwizycji danych w konkretnym używanym urządzeniu qPCR (Rysunek 1). Szybsze protokoły cykli (~45 min), które nie pogarszają wydajności reakcji, zazwyczaj wymagają oprzyrządowania o zwiększonej szybkości narastania temperatury, równomiernego ogrzewania w całym bloku i specjalnie opracowanych odczynników qPCR.

System Illumina Eco™ Real-Time PCR opiera się na zastrzeżonym systemie termicznym, który umożliwia wysoce równomierną kontrolę temperatury i szybkie tempo narastania. Aby uzyskać dokładną kontrolę temperatury, system termiczny Eco™ zawiera precyzyjnie uformowany elektrycznie wydrążony srebrny blok, który jest ogrzewany i chłodzony przez pojedyncze urządzenie Peltiera. Podczas cyklu PCR płyn przewodzący szybko krąży w pustej komorze, przenosząc ciepło z urządzenia Peltiera równomiernie na cały blok. Ta unikalna konstrukcja praktycznie eliminuje nierównomierność termiczną i efekty krawędzi bloku, zapewniając nowy poziom wydajności termicznej ± 0,1 °C jednorodności między dołkami na 48-dołkowej płytce. Rezultatem jest wyższa wydajność qPCR, w tym ściślejsze replikacje oraz lepsza wydajność i specyficzność reakcji.

Polimeraza Taq DNA typu Wild jest teoretycznie zdolna do 30-sekundowego łącznego czasu annealingu i wydłużania wymaganego dla krótkich amplikonów qPCR. Jednak inhibicja spowodowana barwnikiem SYBR^® Green I, przeszkody steryczne z szablonów o wysokiej zawartości GC lub AT oraz niższa aktywność enzymu w temperaturze 60ºC mogą skutkować obniżoną wydajnością reakcji lub nawet niepowodzeniem reakcji, gdy protokoły szybkiego cyklu qPCR są stosowane w połączeniu z odczynnikami zawierającymi polimerazę Taq DNA typu dzikiego.

W przeciwieństwie do tego, zestaw KAPA SYBR^® FAST qPCR Kit zawiera polimerazę DNA drugiej generacji o wewnętrznej zdolności do syntezy DNA znacznie szybciej niż polimeraza Taq DNA typu dzikiego. Polimeraza DNA KAPA SYBR^® została opracowana w drodze ewolucji molekularnej w obecności podwyższonego stężenia barwnika SYBR^® Green I, w wyniku czego enzym wykazuje mniejszą inhibicję SYBR^® Green i szybsze wydłużanie niż polimeraza Taq DNA typu dzikiego. Wysoką siłę sygnału, która jest szczególnie przydatna podczas wykonywania qPCR o małej objętości, uzyskuje się dzięki zwiększonemu stężeniu barwnika SYBR^® Green I w mieszaninie wzorcowej KAPA SYBR^® FAST. Zestawy KAPA SYBR^® FAST qPCR są dostarczane z gorącym startem opartym na przeciwciałach, umożliwiającym krótki czas początkowej aktywacji w temperaturze 95°C. Protokoły PCR wykorzystujące polimerazę DNA KAPA SYBR^® opierają się głównie na skróconych czasach wydłużania, które pozwalają na znaczne skrócenie czasu cyklu PCR bez ryzyka pogorszenia wydajności reakcji.

Rysunek 1. Całkowity czas przebiegu qPCR systemu Illumina Eco™ Real-Time PCR w porównaniu do urządzeń z wolną i szybką prędkością rampy.

Ten sam protokół szybkiego cyklu qPCR i topienia został uruchomiony na wszystkich trzech urządzeniach (40 cykli po 5 s w 95 °C i 30 s w 60 °C, topienie 60 °C - 95 °C). Termocykler z wolnym rampowaniem ma średnią szybkość rampowania 2,5 °C/s, podczas gdy termocykler z szybkim rampowaniem ma średnią szybkość rampowania 6 °C/s ogrzewania i 4 °C/s chłodzenia. Urządzenie Illumina Eco™ Real-Time PCR ma średnią szybkość rampy wynoszącą 5,5 °C/s. Ponadto Eco™ obsługuje ciągłe gromadzenie danych w jednym kanale podczas analizy stopu, co skutkuje zwiększoną liczbą punktów danych i znacznie skróconym czasem przebiegu stopu.

Ustawienie reakcji PCR i warunki cyklu

Prymery zostały zaprojektowane przy użyciu Beacon Designer™ 7 do amplifikacji regionów bogatych w AT i GC w ludzkim genomowym DNA (hgDNA). Zestaw starterów hDMD amplifikował 76,9% amplikonu docelowego bogatego w AT; zestaw starterów ss48422848 amplifikował zrównoważony amplikon docelowy AT/GC (51%), podczas gdy zestaw starterów hKCNG1 amplifikował 78% amplikonu docelowego bogatego w GC.

Amplifikację tych celów przeprowadzono przy użyciu standardowego lub szybkiego protokołu cyklicznego w objętościach reakcji 10 μL. Reakcje te przeprowadzono na 48-dołkowych płytkach Eco™ z optycznymi uszczelkami samoprzylepnymi Eco™ przy użyciu systemu Illumina Eco™ Real-Time PCR System. Konfigurację reakcji KAPA SYBR^® FAST 10 μL przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1. Konfiguracja reakcji zestawu KAPA SYBR Fast qPCR Kit

Składnik reakcji	Koncentracja końcowa	Na 10 μL reakcji1
PCR grade water	-	Up.	Na 10 μL reakcji1
PCR grade water	-	Up to 10.0 μL
2X KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix	1X	5.0 μL
Forward Primer (łącznie 10 μM)	0.2 μM	0,2 μL
Reverse Primer (łącznie 10 μM)	0.2 μM	0,2 μL
szablon hgDNA	15 ng - 15 pg	1.0 μL

¹ Objętości reakcji od 5 μL do 20 μL są zalecane dla Illumina Eco™

.

Tabela 2. Konfiguracja reakcji zestawu KAPA SYBR Fast qPCR Kit

Cycling Step		Temperature and Time
Początkowa denaturacja		5 min w 95˚C	Hold
Denaturacja		15 s w 95˚C	x40 cykli
wygrzewanie/rozszerzanie1		60 s przy optymalnym Ta
Melt	Stop	95˚C	15 sek
	Wygrzewanie	60 ˚C	15 sek
	Melt	95 ˚C	15 sek

¹ Optymalna temperatura wyżarzania (Ta) każdego zestawu starterów była różna. Ta dla amplikonów bogatych w AT i zrównoważonych wynosiła 60 ºC. Ta dla amplikonu bogatego w GC wynosiła 67 ºC.

Tabela 3. Parametry szybkiego cyklu dla Illumina Eco™

Cycling Step		Temperature and Time
Początkowa denaturacja		5 min w 95˚C	Hold
Denaturacja1		5 - 15 sek. w 95˚C	x40 cykli
Ugrzewanie/Przedłużanie2		30 sek. w optymalnej temperaturze Ta
Topienie	Topienie	95˚C	15 sekund
	Wygrzewanie	60 ˚C	15 sekund
	Melt	95 ˚C	15 sek

¹ Czas denaturacji cyklicznej został wydłużony do 15 sekund dla regionu bogatego w GC.
² Optymalna temperatura annealingu (Ta) każdego zestawu starterów była różna. Ta dla bogatych w AT i zrównoważonych amplikonów wynosiła 60 ºC. Ta dla amplikonu bogatego w GC wynosiła 67 ºC

 

Wpływ objętości reakcji na całkowitą fluorescencję i stabilność

Zmniejszone koszty prowadzenia qPCR, szczególnie w połączeniu ze zwiększoną wydajnością, są zawsze pożądane. Zestaw KAPA SYBR^® FAST qPCR Kit zapewnia wysoki poziom fluorescencji i spójne wartości C_q nawet w przypadku stosowania bardzo małych objętości odczynników. Zostało to zilustrowane, gdy cztery różne objętości reakcji (2,5 μL, 5 μL, 10 μL i 20 μL) zostały użyte do amplifikacji ss48422848, docelowego amplikonu 150 bp o zrównoważonej zawartości AT/GC, przy użyciu standardowego protokołu cyklicznego (Tabela 2). Przygotowano 1-krotną mieszaninę wzorcową zawierającą KAPA SYBR^® FAST Master Mix, startery i matrycę, a wymienione objętości reakcji podzielono na dołki PCR w powtórzeniach po sześć. Ponieważ objętość reakcji zmniejszono o połowę, uzyskane wartości C_q odzwierciedlały oczekiwaną 2-krotną zmianę liczby kopii nawet przy najniższej objętości reakcji (20 μL = C_q 20.9, 10 μL = C_q 22.0, 5 μL = C_q 23.0, 2.5 μL = C_q 24.1).

Zmniejszenie objętości reakcji skutkowało niższą fluorescencją odejmowaną od tła. Najmniejsza objętość reakcji nadal zapewniała silny sygnał ze względu na obecność wysokiego stężenia barwnika SYBR^® Green I w mieszaninie KAPA SYBR^® FAST qPCR Master Mix (Rysunek 2).

Rysunek 2. Spadek fluorescencji odejmowanej od tła wraz ze zmniejszeniem objętości reakcji

Równomierny spadek fluorescencji odejmowanej od tła uzyskuje się przy równomiernym zmniejszeniu objętości. Spójna amplifikacja i silny sygnał są nadal uzyskiwane przy 2,5 μL, co jest najniższą zalecaną objętością reakcji.

Wpływ różnych protokołów cykli na wydajność i specyficzność w zakresie amplikonów docelowych bogatych w AT i GC

Aby zademonstrować zdolność do wykonywania szybkich cykli qPCR na amplikonach docelowych bogatych w AT i GC, bez uszczerbku dla wydajności, zestaw czterech 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń hgDNA amplifikowano przy użyciu standardowego lub szybkiego protokołu cyklicznego. Rozkład par zasad każdego amplikonu jest wyświetlany jako wykres GC% (Rysunek 4, górny rząd). Uzyskane wykresy log amplifikacji i krzywe topnienia dla reakcji przeprowadzonych przy użyciu standardowego protokołu i szybkiego protokołu (Rysunek 4, odpowiednio środkowy i dolny wiersz) wskazują, że zarówno specyficzność, jak i wydajność reakcji qPCR nie uległy pogorszeniu w wyniku zastosowania protokołów szybkiego cyklu w stosunku do standardowych protokołów cyklu (opis każdego protokołu Tabela 2 i 3).

Rysunek 3. Wpływ różnych protokołów jazdy na rowerze

Wnioski

Wysokowydajny, szybki qPCR na celach bogatych w AT i GC wymaga instrumentu czasu rzeczywistego zdolnego do niezwykle szybkich ramp z doskonałą jednorodnością temperatury we wszystkich próbkach oraz odczynnika qPCR zawierającego polimerazę DNA zdolną do syntezy DNA znacznie szybciej niż polimeraza Taq DNA typu dzikiego. Połączenie systemu Illumina Eco™ Real-Time PCR i zestawów KAPA SYBR^® FAST qPCR zapewnia wiodące w branży rozwiązanie do wysokowydajnego, szybkiego qPCR bez uszczerbku dla wydajności reakcji, specyficzności i odtwarzalności. Ponadto, możliwość przeprowadzania reakcji qPCR w małych ilościach może obniżyć koszty operacyjne przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej jakości wyników.