Inhibitory trypsyny

• Produkty z inhibitorem trypsyny
• Zastosowanie w hodowli komórkowej
• Trypsin Inhibitor Assay Procedure

Naturalne inhibitory trypsyny znane również jako inhibitory proteaz serynowych (serpiny) są największą i najbardziej zróżnicowaną rodziną inhibitorów proteaz.¹ Serpiny kontrolują aktywację i katabolizm białek poprzez hamowanie proteaz serynowych in vivo.²

Istnieją cztery naturalne źródła inhibitorów trypsyny: trzustka wołowa, ovomucoid, soja i fasola lima. Każdy inhibitor działa jako konkurencyjny analog substratu i wiąże się z jego proteazą serynową, tworząc nieaktywny kompleks, tym samym czyniąc proteazę nieaktywną.³

Proces ten pozwala serpinowi (inhibitorowi trypsyny) zatrzymać aktywność proteolityczną proteazy serynowej, gdy jej funkcja nie jest już potrzebna.

Inhibitory trypsyny zapewniają unikalne procesy w zależności od ich źródła. Na przykład inhibitory w nasionach roślin strączkowych (soi i fasoli lima) działają jako środek odstraszający owady poprzez zakłócanie działania proteaz w jelicie środkowym. Ta naturalna funkcja jest obecnie rozwijana w rozwoju roślin transgenicznych odpornych na owady. Stwierdzono również, że inhibitory soi przyczyniają się do przerostu trzustki u szczurów, ponownie odstraszając owady. Inhibitor soi Bowmana-Birka jest badany jako środek zapobiegający nowotworom.⁴ 

Products

.

Rysunek 1. T0256 - Inhibitor trypsyny z trzustki wołowej

Synonim: BPTI (podstawowy trzustkowy inhibitor trypsyny)
M.W.: ~6,5 kDa (jednołańcuchowy 58-aminokwasowy peptyd)
pI: ~10,5
Aktywność specyficzna: Jeden mg inhibitora trypsyny hamuje więcej niż 1,5 mg trypsyny z aktywnością ~10 000 jednostek BAEE na mg białka
Pochodzi z trzustki pochodzącej z Nowej Zelandii
Rozpuszczalność: Ten produkt jest rozpuszczalny w wodzie (2 mg/ml)

BPTI jest 58 aminokwasowym pojedynczym łańcuchem polipeptydowym z 3 wiązaniami dwusiarczkowymi.⁵

BPTI hamuje zarówno bydlęcą jak i ludzką trypsynę, chymotrypsynę, kalikreinę i plazminę. BPTI nie hamuje elastazy świńskiej.⁶

 

Rysunek 2. T9253 - Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzego (typ II-O)

Synonim: Ovomucoid
M.W.: ~28 kDa
pI: 4.1⁷
Aktywność specyficzna: Jeden mg hamuje 0,8-1,2 mg trypsyny z aktywnością ~10 000 jednostek BAEE na mg białka. Może hamować ≤ 0,3 mg chymotrypsyny o aktywności około 40 jednostek BTEE na mg białka.
Rozpuszczalność: Ten produkt jest rozpuszczalny w 0,67 M buforze fosforanowym, pH 7,6 (2 mg/ml).

Owomukoid kurzy jest główną glikoproteiną, która hamuje trypsynę bydlęcą. Składa się z 186 aminokwasów, które są rozmieszczone w trzech tandemowych domenach.⁸ Każda domena zawiera trzy wiązania dwusiarczkowe, dwie reszty tyrozyny i jedno miejsce aktywne.⁹ Ovomucoid jest opisywany jako jednogłowy inhibitor trypsyny, co oznacza, że każda cząsteczka ovomucoidu wiąże się 1:1 z trypsyną.⁷

Ten produkt zawiera trochę ovoinhibitora. Ovoinhibitor jest kolejnym inhibitorem proteazy pochodzącym z białka jaja kurzego. Ovoinhibitor ma co najmniej pięć miejsc wiązania i jest odpowiedzialny za hamowanie bydlęcej trypsyny, bydlęcej chymotrypsyny i świńskiej elastazy.¹⁰ Trypsyna i chymotrypsyna mają po 2 miejsca wiązania, podczas gdy ostatnie miejsce wiąże elastazę.¹¹ Ovomucoid i Ovoinhibitor to dwa najobficiej występujące inhibitory proteaz w białku jaja kurzego, stanowiące 11 i 1,5% białka.¹²

T2011 - Inhibitor trypsyny z białka jaja kurzego

Typ III-O (wolny od ovoinhibitora)
Synonim: Ovomucoid
M.W.: ~27 kDa
Aktywność specyficzna: Jeden miligram produktu hamuje 1,0-2,0 mg trypsyny o aktywności ~10 000 jednostek BAEE/mg białka
Rozpuszczalność: Ten produkt jest rozpuszczalny w 0,67 M buforze fosforanowym, pH 7,6 (2 mg/ml)

Ten produkt ma takie same właściwości, jak opisane powyżej dla produktu T9253, ale jest dalej oczyszczany przez cięcie siarczanem amonu i proces filtracji w celu wyeliminowania inhibitora ovo. Brak inhibitora ovo skutkuje jeszcze czystszym ovomucoidem, który nadal hamuje trypsynę w kompleksie 1:1.

T4385 - Inhibitor trypsyny z białka jaja indyczego

Typ II-T
Synonim: Turkey Ovomucoid
M.W.: ~20 kDa
Aktywność specyficzna: Jeden mg hamuje 0,9-1,3 mg trypsyny o aktywności ~10 000 jednostek BAEE na mg białka lub 0,4-1,0 mg α-chymotrypsyny o aktywności ~40 jednostek BTEE na mg białka
Rozpuszczalność: Ten produkt jest rozpuszczalny w 0,67 M buforze fosforanowym, pH 7,6 (1 mg/ml)

Inhibitor trypsyny z białka jaja indyczego zawiera dwa niezależne miejsca wiązania, jedno dla trypsyny bydlęcej, a drugie dla α-chymotrypsyny. Przy niskim ph (2,0) trzecia domena (OMTKYT3) rozwija się i hamuje większość proteaz serynowych, które preferują neutralne miejsce kompleksu.¹³

Inhibitory proteaz sojowych Kunitza i Bowmana-Birka (BBI)

Te dwa białka są najbardziej rozpowszechnionymi inhibitorami proteaz w soi. BBI o masie cząsteczkowej 8 kDa jest silnym inhibitorem zarówno trypsyny, jak i chymotrypsyny i zawiera niezależne miejsca wiązania dla każdego z nich. Inhibitor Kunitza o masie cząsteczkowej 20,1 kDa zawiera jedno miejsce wiązania, które silnie hamuje trypsynę, jednocześnie słabo wiążąc chymotrypsynę.

Rysunek 3. Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja): Inhibitor Kunitza

Synonimy: Kunitz Trypsin Inhibitor, Tia1, STI i SBTI
M.W.: 20.1 kDa
pI: 4.5²⁵
Współczynnik ekstynkcji: E1% = 9,94
(280 nm, bufor pH 7,6)

Sojowy inhibitor trypsyny został po raz pierwszy wyizolowany przez Kunitza.¹⁴ W soi znajduje się również kilka innych pokrewnych inhibitorów.¹⁵ Inhibitor trypsyny z soi jest monomerycznym białkiem zawierającym 181 reszt aminokwasowych w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym połączonym krzyżowo dwoma mostkami dwusiarczkowymi.^16-18

Inhibitor trypsyny z soi hamuje trypsynę i w mniejszym stopniu chymotrypsynę¹⁹ i plazminę.²⁰ Inhibitor trypsyny sojowej hamuje również inne proteazy poprzez mechanizm podobny do trypsyny. SBTI działa hamująco na kalikreinę osoczową i czynnik krzepnięcia Xa. Jednak sojowy inhibitor trypsyny nie hamuje metaloproteaz, tkankowej kalikreiny, proteaz kwasowych ani tio proteaz.

Sojowy inhibitor trypsyny tworzy stechiometryczny kompleks 1:1 z miejscem aktywnym proteazy. Po utworzeniu tego kompleksu trypsyna może rozszczepić pojedyncze wiązanie arginina-izoleucyna na inhibitorze.^21,22 Inhibicja jest zarówno odwracalna, jak i zależna od pH. Dysocjacja tego kompleksu może dać zmodyfikowaną lub natywną formę inhibitora.²³ Optymalne pH dla wiązania trypsyny wynosi 8.0 ze stałą asocjacji większą niż 10⁹ przy pH 8,0 i stałą asocjacji 0,15-2,6 x 10⁴ przy pH 3,6-4,4.²⁴

T9003 - inhibitor trypsyny z Glycine max (soja)
Typ I-S
Ten produkt jest oczyszczany chromatograficznie na sefarozie DEAE i zawiera 10% soli buforowej fosforanu sodu, pH 7.6.
Aktywność właściwa: Jeden mg hamuje 1,0-3,0 mg trypsyny o aktywności ~10 000 jednostek BAEE na mg białka.
Jedna jednostka chymotrypsyny hydrolizuje 1,0 µmola BTEE na minutę przy pH 7,8 w temperaturze 25 °C.
Rozpuszczalność: Inhibitor trypsyny jest rozpuszczalny w wodzie i buforach fosforanowych w stężeniu 10 mg/ml. Jest rozpuszczalny w zrównoważonych roztworach soli (1 mg/ml) i w pożywkach bez surowicy. Roztwory o stężeniu wyższym niż 10 mg/ml mogą być mętne i mieć kolor od żółtego do bursztynowego.
Przechowywanie/Stabilność: Ten produkt pozostaje aktywny w zamrożonych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, ale należy unikać zamrażania i rozmrażania. Białko to ulega odwracalnej denaturacji po krótkim podgrzaniu do 80 °C i nieodwracalnej denaturacji po podgrzaniu do 90 °C.¹⁵

T6522 - inhibitor trypsyny z Glycine max (soja)
Typ I-S
Testowany na kulturach komórkowych
Ten produkt jest oczyszczany chromatograficznie na sefarozie DEAE i zawiera 10% soli buforu fosforanu sodu, pH 7.6.
Aktywność specyficzna: Jeden mg hamuje 1-3 mg trypsyny z aktywnością ~10 000 jednostek BAEE na mg białka
Rozpuszczalność: Inhibitor trypsyny jest rozpuszczalny w wodzie i buforach fosforanowych w stężeniu 10 mg/ml. Jest rozpuszczalny w zrównoważonych roztworach soli (1 mg/ml) i w pożywkach bez surowicy. Roztwory o stężeniu wyższym niż 10 mg/ml mogą być mętne i mieć kolor od żółtego do bursztynowego.
Przechowywanie/Stabilność: Ten produkt pozostaje aktywny w zamrożonych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, ale należy unikać zamrażania i rozmrażania. Białko to ulega odwracalnej denaturacji po krótkim podgrzaniu do 80 °C i nieodwracalnej denaturacji po podgrzaniu do 90 °C.¹⁵

T6414 - Trypsin inhibitor from Glycine max (soja)
Ten produkt jest sterylnym przefiltrowanym, 1x roztworem hodowli komórkowej (0.1% roztwór inhibitora trypsyny w PBS Dulbecco), który jest odpowiedni do stosowania w hodowlach komórkowych. Został on zoptymalizowany pod kątem pasażowania komórek śródbłonka.
Przechowywanie/Stabilność: Ten produkt pozostaje aktywny w zamrożonych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, ale należy unikać zamrażania i rozmrażania. Białko to ulega odwracalnej denaturacji po krótkim ogrzaniu do temperatury 80 °C i nieodwracalnej denaturacji po ogrzaniu do temperatury 90 °C.¹⁵

T9008 - inhibitor trypsyny z Glycine max (soja) 1% roztwór w wodzie
Do stosowania w hodowlach komórkowych
Przygotowany z T9003, sterylnie przefiltrowany i przetworzony w celu uzyskania wygodnego roztworu bez buforu.
Przechowywanie/Stabilność: Ten produkt jest przechowywany w temperaturze 2-8 °C. Ten roztwór może być również przechowywany jako zamrożone podwielokrotności w temperaturze -20 °C, ale należy unikać cykli zamrażania-rozmrażania. To białko jest odwracalnie denaturowane przez krótkie ogrzewanie do 80 °C i nieodwracalnie denaturowane przez ogrzewanie do 90 °C.¹⁵

T9128 - Inhibitor trypsyny z Glycine max (soja) 
Typ II-S
Przygotowany przez frakcjonowanie siarczanem amonu wraz z serią etapów klarowania w celu uzyskania produktu zawierającego 90% białka i 10% soli buforu fosforanu sodu, pH 7.6.
Aktywność właściwa: Jeden mg hamuje co najmniej 1,0 mg trypsyny o aktywności ~10 000 jednostek BAEE na mg białka.
Rozpuszczalność: Ten produkt jest rozpuszczalny w wodzie (1 mg/ml). Roztwory o wyższych stężeniach (powyżej 10 mg/ml) mogą być mętne i mieć kolor od żółtego do bursztynowego.
Przechowywanie/Stabilność: Ten produkt pozostaje aktywny w zamrożonych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, ale należy unikać zamrażania i rozmrażania. Białko to ulega odwracalnej denaturacji po krótkim podgrzaniu do 80 °C i nieodwracalnej denaturacji po podgrzaniu do 90 °C.¹⁵

T2327 - inhibitor trypsyny z Glycine Max .(soja)
≥98% inhibitor typu Kunitz
Dalsze oczyszczanie chromatograficzne z T9128 w celu uzyskania czystego inhibitora trypsyny typu Kunitz.
Ten produkt zawiera 10% soli buforu fosforanu sodu, pH 7,6.
Aktywność specyficzna: Jeden mg hamuje ≥ 1,6 mg trypsyny o aktywności ~10 000 jednostek BAEE na mg białka.
Rozpuszczalność: Inhibitor trypsyny jest rozpuszczalny w wodzie i buforach fosforanowych w stężeniach wyższych niż 10 mg/ml może być zamglony i mieć kolor od żółtego do bursztynowego.
Przechowywanie/Stabilność: Ten produkt pozostaje aktywny w zamrożonych podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C, ale należy unikać zamrażania i rozmrażania. To białko ulega odwracalnej denaturacji przez krótkie podgrzanie do 80°C i nieodwracalnej denaturacji przez podgrzanie do 90°C.¹⁵

Inhibitor trypsyny-chymotrypsyny z Glycine max (soja): Inhibitor Bowmana-Birka

Rysunek 4. T9777 - Inhibitor trypsyny-chymotrypsyny z Glycine max (soja)

Synonim: inhibitor Bowmana-Birka (BBI)
Numer CAS: 37330-34-0
Definicja jednostki: Jedna jednostka trypsyny wytworzy ΔA₂₅₃ o wartości 0,001 na min z BAEE jako substratem przy pH 7,6 w temperaturze 25 °C; objętość reakcji 3,2 ml, droga światła 1 cm.
M.W.: 8 kDa²⁹

Inhibitor Bowmana-Birka (BBI) z soi jest monomerycznym białkiem zawierającym 71 aminokwasów w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym usieciowanym siedmioma mostkami dwusiarczkowymi.²⁶ Inhibitor ten zawiera dwa niezależne hamujące miejsca wiązania, jedno dla trypsyny, a drugie dla chymotrypsyny.²⁷ BBI wiąże każdą proteazę, tworząc kompleks 1:1. Ponieważ inhibicja jest niekonkurencyjna, BBI ma zdolność do tworzenia trójskładnikowego kompleksu z obydwoma enzymami.²⁸

Ten produkt jest oczyszczany chromatograficznie na sefarozie DEAE i zawiera 20% soli buforu fosforanu sodu, pH 7,6.
Specyficzna aktywność: Jeden mg białka hamuje ≥0,5 mg trypsyny z aktywnością ~10 000 jednostek BAEE na mg białka.
Jeden mg białka hamuje ≥1,0 mg chymotrypsyny z aktywnością ~40 jednostek BTEE na mg białka.
Rozpuszczalność: Inhibitor trypsyny-chymotrypsyny jest rozpuszczalny w wodzie lub 0,67 M fosforanie sodu, pH 7,6 (1 mg/ml).

Inhibitor trypsyny z Phaseolus limensis (fasola lima):

Synonimy: Inhibitor trypsyny z fasoli lima i LBTI
M.W.: 9 kDa
pI: 4.5²⁵
Współczynnik ekstynkcji: E1% = 9,94
(280nm, bufor pH 7,6)

Inhibitor trypsyny z fasoli lima jest monomerem składającym się z 83 aminokwasów, który ma zdolność do ulegania dimeryzacji zależnej od stężenia. Stopień samoasocjacji zależy od rodzaju wariantu i pH.³⁰

Inhibitor trypsyny z Phaseolus limensis ma od czterech do sześciu wariantów, których aktywność hamująca wobec trypsyny jest zasadniczo identyczna; podczas gdy istnieją pewne różnice w hamowaniu chymotrypsyny. Sekwencje aminokwasowe wariantów są podobne, a każdy z nich zawiera 7 wiązań dwusiarczkowych.³¹

Inhibitor trypsyny tworzy stechiometryczny kompleks 1:1 z miejscem aktywnym proteazy. Kompleks inhibitora z trypsyną lub chymotrypsyną nie ma dalszego działania hamującego wobec większej ilości tego samego enzymu, ale ma pełną aktywność wobec drugiego enzymu (tworząc kompleks 1:1:1).^30,32 Oznacza to, że istnieje jedno miejsce wiązania dla trypsyny i drugie dla chymotrypsyny. Trypsyna wiąże się z miejscem Lys-Ser, podczas gdy chymotrypsyna wiąże się z miejscem Leu-Ser.³¹ Inhibicja jest zarówno odwracalna, jak i zależna od pH. Dysocjacja tego kompleksu może dać zmodyfikowaną lub natywną formę inhibitora.²³ Optymalne pH dla wiązania trypsyny wynosi 8.0 ze stałą asocjacji większą niż 10⁹ przy pH 8,0 i stałą asocjacji 0,15-2,6 x 10⁴ przy pH 3,6-4,4.²⁴

T9378 inhibitor trypsyny z Phaseolus limensis (fasola lima)
Ten produkt jest liofilizowanym proszkiem zawierającym 10% soli buforu fosforanu sodu, pH 7.6.
Specyficzna aktywność: Jeden mg hamuje co najmniej 0,8 mg trypsyny o aktywności ~10 000 jednostek BAEE na mg białka.
Rozpuszczalność: Inhibitor trypsyny jest rozpuszczalny w wodzie i buforach fosforanowych w stężeniu 1 mg/ml. Jest rozpuszczalny w zrównoważonych roztworach soli i w pożywkach bez surowicy. Roztwory o stężeniu wyższym niż 10 mg/ml mogą być mętne i mieć kolor od żółtego do bursztynowego.

Zastosowanie w hodowli komórkowej

Inhibitory trypsyny są stosowane w hodowlach komórkowych w celu dalszego hamowania aktywności tryptycznej podczas dysocjacji komórek, aby zapobiec ich uszkodzeniu/śmierci.

Procedura:
Po trypsynizacji komórek, ponownie zawiesić komórki w 1 ml roztworu inhibitora trypsyny (1 mg/ml przy użyciu zrównoważonego roztworu soli lub pożywki bez surowicy) na każdy ml roztworu trypsyny użytego do dysocjacji. Wirować zawiesinę komórek przy 1000 obr/min przez 5 minut. Powinien powstać osad komórkowy. Usunąć jak najwięcej inhibitora trypsyny i ponownie zawiesić osad w pożywce bez surowicy. Hoduj komórki zgodnie z życzeniem.

Metoda oznaczania aktywności inhibitora trypsyny

Aktywność większości preparatów inhibitora trypsyny jest określana za pomocą testu spektrofotometrycznego o ciągłej szybkości i wyrażana jako hamowanie jednostek BAEE.

Definicja jednostki: Jedna jednostka BAEE wytworzy ΔA253 0,001 na minutę przy pH 7,6 i 25 °C przy użyciu BAEE jako substratu. Objętość reakcji = 3,2 ml.

Warunki
Temp = 25 °C, pH = 7,6, A= 253 nm, ścieżka światła = 1 cm
W mieszaninie reakcyjnej 3.2 ml mieszaniny reakcyjnej końcowe stężenia wynoszą 63 mM fosforanu sodu, 0,23 mM estru etylowego Nα-benzoilo-L-argininy (BAEE), 0,002 mM kwasu solnego, 0,005 mg trypsyny i 0,003 - 0,001 mg inhibitora trypsyny.

Potrzebne odczynniki
S0751 - Sodium Phosphate monobasic
B4500 - chlorowodorek estru etylowego Nα-benzoilo-L-argininy (BAEE)
258148 - Odczynnik ACS z kwasem solnym
T8003 - Trypsyna z trzustki wołowej

Odczynniki

1. 67 mM bufor fosforanu sodu, pH 7.6 w 25 °C
   (Przygotować 100 ml w wodzie dejonizowanej używając Fosforan sodu, jednozasadowy, bezwodny, Nr produktu.S0751. Dostosować do pH 7,6 w 25 °C za pomocą 1 M NaOH.)
2. 0.25 mM roztwór estru etylowego Nα-benzoilo-L-argininy (BAEE)
   (Przygotuj 50 ml w odczynniku a używając estru etylowego Nα-benzoilo-L-argininy, chlorowodorek, nr produktu.B4500.)
3. 1 mM roztwór kwasu chlorowodorowego (HCl)
   (Przygotuj 50 ml w wodzie dejonizowanej używając stężonego  kwasu chlorowodorowego, Nr produktu. 258148.)
4. Roztwór enzymu trypsyny (Trypsin)
   (Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 1 mg białka/ml Trypsin, Product No. T8003, w zimnym Odczynniku C.)
5. Roztwór inhibitora trypsyny (Inhib.)
   (Bezpośrednio przed użyciem przygotować roztwór zawierający 1,0 mg/ml inhibitora trypsyny w zimnym odczynniku A).)

Procedura
Odmierzyć pipetą (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich kuwet kwarcowych

Część A:

	Uninh	Test 1	Test 2<	Test 3	Test 4	Test 5
Odczynnik e (Inhib.)	-	0.10	0.15	0.20	0.25	0.30
Odczynnik d (Trypsyna)	0,50	0.50	0.50	0.50	0.50	0.50
Odczynnik c (HCl)	9.50	9.40	9.35	9.30	9.25	9.20

Pozostawić w temperaturze 25 °C na co najmniej pięć minut i nie dłużej niż sześć minut.

Zmieszać przez odwrócenie i odpipetować (w mililitrach) następujące odczynniki do odpowiednich kuwet:

Część B:

	Uninh	Test 1	Test 2	Test 3<	Test 4	Test 5	Puste
Odczynnik b (BAEE)	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00	3.00
Odczynnik c (HCl)	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.10	0.20

Wymieszać przez odwrócenie i wyrównać do 25 °C. Monitorować A_253nm aż do uzyskania stałej wartości, używając odpowiednio termostatowanego spektrofotometru. Następnie dodać:

Uninh (Part A)	0.10	-	-	-	-	-	-
Test 1 (Część A)	-	0.10	-	-	-	-	-
Test 2 (Część A)	-	-	0.10	-	-	-	-
Test 3 (Część A)	-	-	-	0.10	-	-	-
Test 4 (Część A)	-	-	-	-	0.10	-	-
Test 5 (Część A)	-	-	-	-	-	0.10	-

Natychmiast wymieszać przez odwrócenie i rejestrować wzrost A_253nm przez około 5 minut. Uzyskaj ΔA_253nm/minutę, używając maksymalnej szybkości liniowej dla testów, roztworu ślepego i niezahamowanego.

Obliczenia

Aktywność trypsyny w jednostkach BAEE/ml enzymu =

(ΔA253nm/min Test - ΔA253nm/min Blank)(df)(10.0) (0.001)(0.10)(0.5)

.

df = Współczynnik rozcieńczenia
0,001 = Zmiana A253nm/minutę na jednostkę trypsyny przy pH 7,6 w temperaturze 25 °C w 3,2 ml mieszaniny reakcyjnej
0.10 = Objętość (w mililitrach) użytego enzymu (część B)
10,0 = Całkowita objętość w mililitrach testu (część A)
0,5 = Objętość (w mililitrach) użytego enzymu (część A)

.   Units/mg solid =

jednostki/mL enzymu mg stałe/mL enzymu

.

Wykres aktywności trypsyny (jednostki BAEE/mg białka) w zależności od mL inhibitora trypsyny/RM
Mg inhibitora trypsyny = (mL inhibitora trypsyny)(stężenie inhibitora trypsyny, mg/mL)

Mg trypsyny hamowane przez 1 mg inhibitora trypsyny =

mg Trypsyny/RM (współczynnik normalizujący) mg Inhibitora Trypsyny (z wykresu)

.

Współczynnik normalizujący = (jednostki BAEE niehamowanej trypsyny na mg substancji stałej/10 000 jednostek BAEE trypsyny na specyfikację).)

Uwagi:

1. Ten test enzymatyczny jest używany do oznaczania numerów produktów: T9003, T9008. T9128, T9253, T2011, T4385T9378, oraz T0256.
2. Przy oznaczaniu inhibitora trypsyny, typ II-S, numer produktu  T9128, należy przygotować roztwór zawierający 0,60 mg/ml inhibitora trypsyny w zimnym odczynniku a.
3. Niehamowana aktywność trypsyny powinna mieścić się w zakresie 85% wartości uwalniania dla aktywności.
4. Przy 11 700 do 13 005 jednostkach trypsyny/mg ciała stałego na etykietę, dopuszczalny zakres aktywności niehamowanej reakcji trypsyny powinien wynosić od 10 000 do 15 300 jednostek trypsyny/mg ciała stałego. Zakres ten powinien również odpowiadać skorygowanemu ΔAbs_253nm/minutę od 0,0545 do 0,0835. Przy tej szybkości i inhibicji od 20% do 80%, ΔAbs_253nm/minutę powinno być powyżej granicy wykrywalności spektrofotometru wynoszącej 0,0020.

Przeliczanie jednostek trypsyny
1 jednostka BAEE µM = 200 jednostek BAEE
1 jednostka TAME µM = 0.27 jednostek BAEE µM
1 jednostka BAEE µM = 3,64 jednostek TAME
1 jednostka TAME µM = 55 jednostek BAEE A253 Units
1 jednostka BAEE A253 Unit = 0.018 TAME µM Unit
1 TAME µM Unit = 180 TAME A247 Units
1 TAME A247 Unit = 0.33 BAEE Units
1 USP Unit = 3.0 BAEE Units
1 NF Unit = 1.1 USP Units

Referencje

1. RAWLINGS ND, TOLLE DP, BARRETT AJ. 2004. Evolutionary families of peptidase inhibitors. 378(3):705-716. https://doi.org/10.1042/bj20031825

2. Silverman GA, Bird PI, Carrell RW, Church FC, Coughlin PB, Gettins PGW, Irving JA, Lomas DA, Luke CJ, Moyer RW, et al. 2001. The Serpins Are an Expanding Superfamily of Structurally Similar but Functionally Diverse Proteins. J. Biol. Chem.. 276(36):33293-33296. https://doi.org/10.1074/jbc.r100016200

3. Zhou J, Liu C, Tsou C. 1989. Kinetics of trypsin inhibition by its specific inhibitors. Biochemistry. 28(3):1070-1076. https://doi.org/10.1021/bi00429a022

4. Kennedy AR. 1998. The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as an anticarcinogenic agent. 68(6):1406S-1412S. https://doi.org/10.1093/ajcn/68.6.1406s

5. Huber R, Kukla D, Ruhlmann A, Steigemann W. 1972. Pancreatic Trypsin Inhibitor (Kunitz): Part I: Structure and function. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 36(0):141-150. https://doi.org/10.1101/sqb.1972.036.01.019

6. Pancreatic trypsin inhibitor precursor - Bos taurus (Bovine). [Internet]. Universal Protein Resource (UniProt).[updated 21 Apr 2020; cited 17 Jul 2020]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprot/P00974

7. Stadelman W, Owen C. 1995. Egg Science and Technology. $. New York: Haworth Press Inc..

8. Cooke S, Sampson H. 1997. Allergenic properties of ovomucoid in man. J Immunol.. 159(4):2026-2032.

9. Salahuddin A, Sibghatullah, Baig MA. 1985. Homologous structural domains in chicken egg-white ovomucoid: Characterization and acid denaturation. J. Biosci.. 8(1-2):67-87. https://doi.org/10.1007/bf02703968

10. BEGUM S, SAITO A, XU X, KATO A. 2003. Improved Functional Properties of the Ovoinhibitor by Conjugating with Galactomannan. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 67(9):1897-1902. https://doi.org/10.1271/bbb.67.1897

11. GERTLER A, BEN-VALID I. 1980. Stoichiometry of Interaction of Chicken Ovoinhibitor with Pancreatic Trypsin, Chymotrypsin and Elastase I. Eur J Biochem. 110(2):571-577. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1980.tb04900.x

12. Kinoshita K, Shimogiri T, Okamoto S, Yoshizawa K, Mannen H, Ibrahim HR, Cheng HH, Maeda Y. 2004. Linkage mapping of chickenovoinhibitorandovomucoidgenes to chromosome 13. 35(4):356-358. https://doi.org/10.1111/j.1365-2052.2004.01159.x

13. Song J, Laskowski, M, Qasim MA, Markley JL. 2003. Two Conformational States of Turkey Ovomucoid Third Domain at Low pH:  Three-Dimensional Structures, Internal Dynamics, and Interconversion Kinetics and Thermodynamics?,?. Biochemistry. 42(21):6380-6391. https://doi.org/10.1021/bi034053f

14. KUNITZ M. 1945. CRYSTALLIZATION OF A TRYPSIN INHIBITOR FROM SOYBEAN. Science. 101(2635):668-669. https://doi.org/10.1126/science.101.2635.668

15. Steiner RF, Frattali V. 1969. Purification and properties of soybean protein inhibitors of proteolytic enzymes. J. Agric. Food Chem.. 17(3):513-518. https://doi.org/10.1021/jf60163a001

16. KIM S, HARA S, HASE S, IKENAKA T, TODA H, KITAMURA K, KAIZUMA N. 1985. Comparative Study on Amino Acid Sequences of Kunitz-Type Soybean Trypsin Inhibitors, Tia, Tib, and Tic1. 98(2):435-448. https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.jbchem.a135298

17. Steiner R. 1965. The reduction and reoxidation of the disulfide bonds of soy-bean trypsin inhibitor. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 100(1):111-121. https://doi.org/10.1016/0304-4165(65)90433-2

18. Koide T, IKENAKA T. 1973. Studies on Soybean Trypsin Inhibitors. 1. Fragmentation of Soybean Trypsin Inhibitor (Kunitz) by Limited Proteolysis and by Chemical Cleavage. Eur J Biochem. 32(3):401-407. https://doi.org/10.1111/j.1432-1033.1973.tb02622.x

19. Bidlingmeyer UDV, Leary TR, Laskowski M. 1972. Identity of the tryptic and ?-chymotrypic reactive sites on soybean trypsin inhibitor (Kunitz). Biochemistry. 11(17):3303-3310. https://doi.org/10.1021/bi00767a028

20. Nanninga L, Guest M. 1964. On the interaction of fibrinolysin (plasmin) with the inhibitors antifibrinolysin and soybean trypsin inhibitor. Archives of Biochemistry and Biophysics. 108(3):542-551. https://doi.org/10.1016/0003-9861(64)90440-0

21. Ozawa K, Laskowski Jr M. 1966. The reactive site of trypsin inhibitors. J. Biol. Chem.. 241(17):2955-61.

22. R WR, Laskowski Jr. M. 1967. Resynthesis by Trypsin of the Cleaved Peptide Bond in Modified Soybean Trypsin Inhibitor. J. Biol. Chem.. 242(4):771-3.

23. Finkenstadt WR, Laskowski Jr. M. 1965. Peptide Bond Cleavage on Trypsin-Trypsin Inhibitor Complex Formation. J. Biol. Chem.. 240(2):PC962-3.

24. Laskowski M, Laskowski M. 1954. Naturally Occurring Trypsin Inhibitors.203-242. https://doi.org/10.1016/s0065-3233(08)60207-7

25. Kunitz M. 1947. ISOLATION OF A CRYSTALLINE PROTEIN COMPOUND OF TRYPSIN AND OF SOYBEAN TRYPSIN-INHIBITOR. 30(4):311-320. https://doi.org/10.1085/jgp.30.4.311

26. Bowman-Birk type proteinase inhibitor precursor - Glycine max (Soybean). [Internet]. Universal Protein Resource (UniProt).[updated 16 Jun 2020; cited 17 Jul 2020]. Available from: https://www.uniprot.org/uniprot/P01055

27. Kay E. 1979. Structure-function relationships of proteinase inhibitors from soybean (Bowman-Birk) and lima bean. Modification by N-acetylimidazole. J. Biol. Chem.. 254(16):7648-50.

28. BIRK Y. The Bowman-Birk inhibitor. Trypsin- and chymotrypsin-inhibitor from soybeans. 25(2):113-131. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1985.tb02155.x

29. DiPietro CM, Liener IE. 1989. Heat inactivation of the Kunitz and Bowman-Birk soybean protease inhibitors. J. Agric. Food Chem.. 37(1):39-44. https://doi.org/10.1021/jf00085a010

30. Birk Y. 1976. [59] Lima bean trypsin inhibitors.707-709. https://doi.org/10.1016/s0076-6879(76)45062-0

31. Nordlund TM, Liu XY, Sommer JH. 1986. Fluorescence polarization decay of tyrosine in lima bean trypsin inhibitor.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 83(23):8977-8981. https://doi.org/10.1073/pnas.83.23.8977

32. Kassell B. 1970. [66d] Trypsin inhibitors forom other legumes.862-871. https://doi.org/10.1016/0076-6879(70)19076-8