Rozmrażanie zamrożonych linii komórkowych

ECACC Laboratory Handbook

4th Edition

Wiele kultur uzyskanych z kolekcji kultur, takich jak ECACC, zostanie dostarczonych w stanie zamrożonym, a w celu wykorzystania komórek należy je rozmrozić i umieścić w kulturze. Prawidłowe rozmrożenie komórek ma kluczowe znaczenie dla utrzymania żywotności hodowli i umożliwienia jej szybszej regeneracji. Niektóre krioprotektanty, takie jak DMSO, są toksyczne w temperaturze powyżej 4 °C. Dlatego ważne jest, aby hodowle były szybko rozmrażane i rozcieńczane w podłożu hodowlanym w celu zminimalizowania efektów toksycznych.

Materiały

• Podłoże do hodowli komórkowej: wstępnie ogrzane do odpowiedniej temperatury (patrz arkusz danych linii komórkowej ECACC w celu uzyskania prawidłowej pożywki i temperatury).)
• 70% (v/v) alkohol w sterylnej wodzie (793213)
• DMSO (D2650)
• Roztwór błękitu trypanu (T8154)

Wyposażenie

• Środki ochrony osobistej (sterylne rękawiczki, fartuch laboratoryjny, przyłbica ochronna)
• Kontener do transportu zamrożonych ampułek np.g. pojemnik z suchym lodem lub dewar z ciekłym azotem
• Łaźnia wodna ustawiona na odpowiednią temperaturę
• Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego na odpowiednim poziomie hermetyczności
• Inkubator
• Znakowane kolby
• Odwrócony mikroskop z kontrastem fazowym
• Hemocytometr lub automatyczny licznik komórek, taki jak Scepter™ Cell Counter
• Centrifuge
• Marker Pen
• Pipety
• Stojak na ampułki
• Tkanka

Procedura

1. Przeczytać arkusz danych linii komórkowej w celu ustalenia specyficznych wymagań dla danej linii komórkowej.
2. Przygotować kolby: oznaczyć nazwą linii komórkowej, numerem pasażu i datą.
3. Pobrać ampułkę komórek z magazynu ciekłego azotu w odpowiednim sprzęcie ochrony osobistej i przenieść do laboratorium w pojemniku z ciekłym azotem lub w suchym lodzie. Ważne jest, aby obchodzić się z ampułkami ostrożnie: w rzadkich przypadkach ampułki mogą eksplodować podczas ogrzewania z powodu ekspansji uwięzionego resztkowego ciekłego azotu.
4. W szafce bezpieczeństwa mikrobiologicznego przytrzymaj chusteczkę nasączoną 70% alkoholem wokół nasadki zamrożonej ampułki i obróć nasadkę o ćwierć obrotu, aby uwolnić resztkowy ciekły azot, który może być uwięziony. Ponownie dokręcić nasadkę. Szybko przenieś ampułkę do łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż pozostanie tylko jeden lub dwa małe kryształki lodu (1-2 minuty). Ważne jest szybkie rozmrożenie, aby zminimalizować wszelkie uszkodzenia błon komórkowych.
5. Uwaga: Nie należy całkowicie zanurzać ampułki, ponieważ może to zwiększyć ryzyko zanieczyszczenia.
6. Przed otwarciem przetrzeć ampułkę chusteczką nasączoną 70% alkoholem.
7. Pipetą pobrać całą zawartość ampułki do sterylnej probówki (np. o pojemności 15 ml), o pojemności 15 ml). Następnie powoli dodaj 5 ml wstępnie ogrzanej pożywki, która została już uzupełniona odpowiednimi składnikami. Określić gęstość żywych komórek za pomocą błękitu trypanu. Przenieś odpowiednią objętość zawiesiny komórek do kolby, aby uzyskać gęstość wysiewu komórek zalecaną w arkuszu danych linii komórkowej.

8. Dla adherentnych linii komórkowych: Dostosuj objętość pożywki i, jeśli to konieczne, rozmiar kolby, aby osiągnąć gęstość wysiewu komórek zalecaną w arkuszu danych linii komórkowej. Etap wstępnego wirowania w celu usunięcia krioprotektantu nie jest zwykle konieczny, ponieważ pierwsza zmiana pożywki usunie pozostałości krioprotektantu. Jeśli tak jest, zostanie to określone w arkuszu danych. Jeśli komórki mają być użyte natychmiast (np. do testu opartego na komórkach), a nie subkulturowane, może być wskazane wykonanie etapu wstępnego wirowania w celu usunięcia krioprotektantu.
   
9. Dla zawiesinowych linii komórkowych: Zaleca się etap wstępnego wirowania w celu usunięcia krioprotektantu, tj.tj. odwirować komórki z prędkością 150 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić osad komórkowy w świeżej pożywce, używając odpowiedniej objętości, aby uzyskać prawidłową gęstość wysiewu.
10. Inkubować w temperaturze i na poziomie CO₂ zalecanym w karcie danych. Jeśli używany jest inkubator zasilany CO₂ kolba powinna mieć wentylowaną pokrywę, aby umożliwić wymianę gazową.
11. Zbadaj komórki mikroskopowo (kontrast fazowy) po 24 godzinach i podhoduj w razie potrzeby.

.

Kluczowe punkty

1. Większość podręczników zaleca płukanie rozmrożonych komórek w pożywce w celu usunięcia krioprotektantu. Jest to konieczne tylko wtedy, gdy wiadomo, że krioprotektant ma niekorzystny wpływ na określony typ komórek. Na przykład, niektóre typy komórek różnicują się w obecności DMSO. W takich przypadkach komórki powinny być płukane w pożywce przed dodaniem ich do kolb hodowlanych.
2. Dodanie rozmrożonej zawiesiny komórek do pożywki hodowlanej skutecznie rozcieńcza krioprotektant (np. DMSO), zmniejszając toksyczność krioprotektantu. Dlatego ważne jest, aby dodać rozmrożoną zawiesinę komórek do większej objętości pożywki hodowlanej natychmiast po rozmrożeniu ampułki; nie pozwól, aby rozmrożone ampułki pozostawały w temperaturze pokojowej przez długi czas.
3. Nie używaj inkubatora ani dłoni do rozmrażania kultur komórkowych, ponieważ osiągnięte tempo rozmrażania jest zbyt wolne, co powoduje utratę żywotności. Użyj łaźni wodnej, jak opisano w powyższym protokole.
4. Jeśli inkubator CO₂ nie jest dostępny, gazuj kolby przez 1-2 minuty 5% CO₂ w 95% powietrzu przefiltrowanym przez filtr 0.2μm.
5. Dla większości kultur najlepszą praktyką jest subkultura przed osiągnięciem konfluencji, tak aby komórki zostały zebrane w fazie logarytmicznego wzrostu i miały optymalną żywotność gotową do wysiewu do nowych kolb. Ponadto, istnieją pewne specyficzne typy komórek, które muszą być podhodowane przed osiągnięciem konfluencji w celu zachowania ich właściwości, np. inhibicja kontaktowa komórek NIH3T3 jest tracona, jeśli pozwoli się im wielokrotnie osiągnąć konfluencję.
6. Niektóre hybrydomy mogą powoli regenerować się po reanimacji, dlatego należy rozpocząć hodowlę w 20% (v/v) FBS w odpowiednim podłożu.

Wideo poradnik: Jak rozmrażać komórki z wysoką wydajnością

Obejrzyj ten samouczek, aby poznać najlepsze praktyki dotyczące rozpoczynania hodowli świeżych komórek z zamrożonych zapasów, wskazówki dotyczące rozmrażania komórek i sztuczki pozwalające zmaksymalizować przeżywalność hodowli.