Wyciąg z błony podstawnej Cultrex^®, typ 2, protokół PathClear^®

Opis produktu

Błony podstawne to ciągłe arkusze wyspecjalizowanej macierzy zewnątrzkomórkowej, które tworzą interfejs między komórkami śródbłonka, nabłonka, mięśni lub neuronów a sąsiadującym z nimi zrębem. Błony podstawne są degradowane i regenerowane podczas rozwoju i gojenia się ran. Nie tylko wspierają komórki i warstwy komórek, ale także odgrywają istotną rolę w organizacji tkanek, która wpływa na adhezję, migrację, proliferację i różnicowanie komórek. Błony podstawne stanowią główną barierę dla inwazji przerzutowych komórek nowotworowych.

Cultrex^® Basement Membrane Extract (BME) jest rozpuszczalną formą błony podstawnej oczyszczonej z guza Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Ekstrakt żeluje w temperaturze 37 ⁰C, tworząc odtworzoną błonę podstawną. Główne składniki BME obejmują lamininę, kolagen IV, entaktynę i proteoglikan siarczanu heparyny.

BME może być stosowany w wielu aplikacjach, w różnych warunkach hodowli komórkowej, w celu utrzymania wzrostu lub promowania różnicowania pierwotnych komórek śródbłonka, nabłonka, mięśni gładkich i komórek macierzystych. BME może być również wykorzystywany do przyłączania komórek, wzrostu neurytów, angiogenezy, inwazji komórek in vitro i testów nowotworowości in vivo. Niedawno opracowaliśmy dwie dodatkowe formuły Cultrex^® BME znane jako Cultrex^® BME Typ 2 i Cultrex^® BME Typ 3. Cultrex^® BME Type 2 zapewnia zastrzeżoną formułę, która ma wyższą wytrzymałość na rozciąganie w porównaniu z naszym oryginalnym BME, podczas gdy Cultrex^® BME Type 3 jest fizjologicznie dostosowany do środowiska guzów litych in vivo i jest zalecany do ksenograftów i innych zastosowań in vivo.

Specyfikacja

1. Stężenie: 12 - 18 mg/ml
2. Źródło: Murine Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumor
3. Bufor do przechowywania: Zmodyfikowane podłoże Eagle'a Dulbecco bez czerwieni fenolowej (nr produktu D5030), z siarczanem gentamycyny 10 μg/mL (nr produktu G1264)

Środki ostrożności i ograniczenia

1. Wyłącznie do użytku badawczego. Nie do użytku w procedurach diagnostycznych.
2. Właściwości fizyczne, chemiczne i toksykologiczne tych produktów mogą nie być jeszcze w pełni zbadane; dlatego zalecamy stosowanie rękawic, fartuchów laboratoryjnych i ochrony oczu podczas korzystania z tych odczynników chemicznych.

Kwalifikacja materiału

1. Testy funkcjonalne
   Test tworzenia rurek - BME promuje tworzenie struktur kapilarnych przez ludzkie (HBMVEC; HUVEC) lub mysie (SVEC4-10) komórki śródbłonka.
2. Testy stabilności
   1. PathClear^® - Negatywny wynik testu PCR na obecność mykoplazmy; 17 szczepów bakterii i wirusów zwykle uwzględnianych w testach produkcji przeciwciał u myszy (MAP) oraz 13 dodatkowych mysich czynników zakaźnych, w tym LDEV, łącznie 31 organizmów i wirusów
   2. Nie wykryto wzrostu bakterii ani grzybów po inkubacji w temperaturze 37 ⁰C przez 14 dni zgodnie z wytycznymi USP dotyczącymi badań sterylności
   3. Stężenie endotoksyny ≤8 EU/ml w teście LAL
3. Żelowanie
   BME żeluje w czasie krótszym niż 30 minut w temperaturze 37 ⁰C i utrzymuje postać żelu w pożywce hodowlanej przez co najmniej 14 dni w temperaturze 37 ⁰C.

Nazwa	Bufor	Wytrzymałość na rozciąganie	Stężenie	Zastosowania
Cultrex® BME, PathClear	DMEM	medium	12 - 18 mg/ml	ksenograft/tumorgraft, hodowla komórkowa 2D, sferoidy/organoidy hodowli 3D, komórki macierzyste
Cultrex® BME, typ 2, PathClear®	DMEM	high	12 - 18 mg/ml	xenograft/tumorgraft, hodowla komórkowa 2D, sferoidy/organoidy hodowli 3D, komórki macierzyste
Cultrex® BME, Type 3, PathClear®	RPMI1640	high	12 - 18 mg/ml	xenograft/tumorgraft

Przechowywanie i stabilność

Produkt jest stabilny przez co najmniej 3 miesiące od daty wysyłki, jeśli jest przechowywany w temperaturze -20 ⁰C w ręcznie rozmrażanej zamrażarce. Aby uzyskać optymalną stabilność, należy przechowywać w temperaturze -80 ⁰C. Unikać cykli zamrażania-rozmrażania.

Protokół powlekania

Odmrozić Cultrex^® BME przez noc w temperaturze 2-8 ⁰C. Temperatury w lodówce mogą się różnić, dlatego zaleca się przechowywanie BME na lodzie w lodówce podczas procesu rozmrażania. Rozmrożony BME szybko krzepnie w temperaturach powyżej 15 ⁰C; podczas pracy z ekstraktem należy trzymać go na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu żelowaniu.

Istnieje wiele zastosowań dla Cultrex^® BME, które wymagają różnych grubości i stężeń. Ogólnie rzecz biorąc, BME o stężeniu białka ≥ 10 mg/ml jest stosowany do badań różnicowania komórek pierwotnych. Do zastosowań takich jak tworzenie przez komórki śródbłonka struktur podobnych do naczyń włosowatych (Tube Formation Assay), różnicowanie tkanki aorty szczurzej w struktury podobne do naczyń włosowatych (Aortic Ring Assay), tworzenie organoidów nabłonkowych lub tworzenie organoidów nowotworowych, potrzebny jest gęsty żel. Niektóre zastosowania, takie jak rozmnażanie komórek pierwotnych, wymagają cienkowarstwowej powłoki, a nie grubego żelu; dlatego też należy stosować metodę cienkowarstwową.

Metoda grubego żelu

1. Odwilż BME jak opisano powyżej.
2. Wymieszaj BME powoli pipetując roztwór w górę i w dół; uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
3. Nanieś pipetą 200-300 μL na cm² na powierzchnię wzrostu.
4. Umieść pokryty obiekt w temperaturze 37 ⁰C na 30 minut.
5. Pokryte obiekty są gotowe do użycia.

Metoda cienkowarstwowa (nieżelująca)

1. Obrób BME jak opisano powyżej.
2. Mieszaj BME powoli pipetując roztwór w górę i w dół; uważaj, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza.
3. Rozcieńcz BME do pożądanego stężenia w zimnym podłożu bez surowicy. Może być wymagane empiryczne określenie optymalnego stężenia powłoki dla danego zastosowania. Stężenie białka wynoszące 150 μg/ml jest zalecanym stężeniem początkowym do rozmnażania komórek pierwotnych.
4. Dodaj wystarczającą ilość roztworu, aby pokryć cały obszar na powierzchni wzrostu. Zaleca się objętość 300 μL na cm².
5. Inkubować pokryty obiekt w temperaturze pokojowej przez godzinę.
6. Wdmuchnąć roztwór powlekający i natychmiast umieścić komórki na płytce. Nie dopuścić do wyschnięcia pokrytej powierzchni.

Informacje prawne

Cultrex i PathClear są zastrzeżonymi znakami towarowymi firmy Trevigen, Inc.

.

Referencje

1. Albini A, Iwamoto Y, Kleinman H, Martin G, Aaronson S, Kozlowski J, McEwan R. 1987. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res.. 473239-3245.

2. Fridman R, Giaccone G, Kanemoto T, Martin GR, Gazdar AF, Mulshine JL. 1990. Reconstituted basement membrane (matrigel) and laminin can enhance the tumorigenicity and the drug resistance of small cell lung cancer cell lines.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 87(17):6698-6702. https://doi.org/10.1073/pnas.87.17.6698

3. Fridman R, Kibbey MC, Royce LS, Zain M, Sweeney TM, Jicha DL, Yannelli JR, Martin GR, Kleinman HK. 1991. Enhanced Tumor Growth of Both Primary and Established Human and Murine Tumor Cells in Athymic Mice After Coinjection With Matrigel. JNCI Journal of the National Cancer Institute. 83(11):769-774. https://doi.org/10.1093/jnci/83.11.769

4. Fridman R, Sweeney TM, Zain M, Martin GR, Kleinman HK. 1992. Malignant transformation of NIH-3T3 cells after subcutaneous co-injection with a reconstituted basement membrane (matrigel). Int. J. Cancer. 51(5):740-744. https://doi.org/10.1002/ijc.2910510513

5. Kubota Y, Kleinman HK, Martin GR, Lawley TJ. 1988. Role of laminin and basement membrane in the morphological differentiation of human endothelial cells into capillary-like structures.. 107(4):1589-1598. https://doi.org/10.1083/jcb.107.4.1589

6. Ponce ML, Nomizu M, Delgado MC, Kuratomi Y, Hoffman MP, Powell S, Yamada Y, Kleinman HK, Malinda KM. 1999. Identification of Endothelial Cell Binding Sites on the Laminin ?1 Chain. Circulation Research. 84(6):688-694. https://doi.org/10.1161/01.res.84.6.688

7. Eisenstein M. 2006. Thinking outside the dish. Nat Methods. 3(12):1035-1043. https://doi.org/10.1038/nmeth1206-1035

8. Benton G, George J, Kleinman H, Arnaoutova I. 2009. Advancing science and technology via 3D culture on basement membrane matrix. J. Cell. Physiol.. 221(1):18-25. https://doi.org/10.1002/jcp.21832

9. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. 2009. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12(3):267-274. https://doi.org/10.1007/s10456-009-9146-4

10. Arnaoutova I, Kleinman HK. 2010. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5(4):628-635. https://doi.org/10.1038/nprot.2010.6

11. Benton G, Kleinman HK, George J, Arnaoutova I. 2011. Multiple uses of basement membrane-like matrix (BME/Matrigel) in vitro and in vivo with cancer cells. Int. J. Cancer. 128(8):1751-1757. https://doi.org/10.1002/ijc.25781

12. Arnaoutova I, George J, Kleinman HK, Benton G. 2012. Basement Membrane Matrix (BME) has Multiple Uses with Stem Cells. Stem Cell Rev and Rep. 8(1):163-169. https://doi.org/10.1007/s12015-011-9278-y

13. Fridman R, Benton G, Aranoutova I, Kleinman HK, Bonfil RD. 2012. Increased initiation and growth of tumor cell lines, cancer stem cells and biopsy material in mice using basement membrane matrix protein (Cultrex or Matrigel) co-injection. Nat Protoc. 7(6):1138-1144. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.053