Testowanie komórek pod kątem zanieczyszczenia bakteriami i grzybami

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Aim

.

W przypadku poważnego zanieczyszczenia hodowli komórkowej, gołym okiem można zidentyfikować obecność bakterii i grzybów. Jednak w celu wykrycia infekcji niskiego poziomu zalecana jest powyższa metoda.

Materiały

• Aerobowy bulion odżywczy (Tryptone Soy Broth (22092))
• Beztlenowy bulion odżywczy (Thioglycollate Medium (T9032))
• Dodatnie organizmy kontrolne np.
• Bacillus subtilis NCTC*
• Candida albicans NCTC*
• Clostridium sporogenes NCTC*
• * Dostępne w National Collection of Type Cultures (NCTC)

Sprzęt

• Środki ochrony osobistej (lateksowe rękawiczki medyczne, fartuch laboratoryjny, okulary ochronne)
• Łaźnia wodna ustawiona na 37°C
• Szafa bezpieczeństwa mikrobiologicznego na odpowiednim poziomie hermetyczności
• Inkubator ustawiony na 32 °C
• Inkubator ustawiony na 22 °C

.Procedura

1. Hoduj linię komórkową bez antybiotyków przez 2 pasaże przed badaniem.
2. Przynieść dołączone komórki do zawiesiny za pomocą skrobaka do komórek. Linie komórkowe w zawiesinie mogą być testowane bezpośrednio.
3. Zaszczepić 2 x buliony tlenowe i 2 x buliony beztlenowe 1,5 ml próbki testowej.
4. Dla każdego z pozytywnych organizmów kontrolnych zaszczepić 2 x buliony tlenowe i 2 x buliony beztlenowe (np. 0,1 ml kontroli przy 100 jtk na bulion).
5. Zaszczepić 2 x buliony tlenowe i 2 x buliony beztlenowe 1,5 ml sterylnego PBS.5 ml sterylnego PBS
6. Inkubować buliony w następujący sposób:
   - Buliony Thio inkubować w temperaturze 32 °C, a buliony TSB w temperaturze 22 °C
7.  Zbadać buliony testowe w dniach:  
   - 3, 4 lub 5
   - 7 lub 8
   -  14
   - buliony kontrolne są odczytywane po 7 dniach

Kryteria uzyskania ważnego wyniku

Wszystkie buliony kontroli pozytywnej wykazują obecność bakterii i grzybów po 7 dniach inkubacji, a buliony kontroli negatywnej i PBS nie wykazują obecności bakterii i grzybów.

Kryteria wyniku pozytywnego

Brosole testowe zawierające bakterie lub grzyby wykazują zmętnienie.

Kryteria dla wyniku negatywnego

Brosole testowe powinny być klarowne i nie wykazywać zmętnienia.

Uwagi

1. Organizmy kontrolne (Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes i Candida albicans) są dostępne w National Collection of Type Cultures (NCTC), UK.

2. Ta procedura testowa powinna być przeprowadzona w laboratorium mikrobiologicznym z dala od laboratorium hodowli komórkowych.

3.