Analiza aktywnych związków konopi indyjskich w jadalnych produktach spożywczych: Gummy Bears i Brownies

Olga Shimelis, Principle R&D Scientist, Kathy Stenerson, Principle R&D Scientist, Margaret Wesley

2016 R&D Summer Intern from Pennsylvania State University, State College, PA

Article from Analytix Reporter - Issue 4

Abstract

Opracowano metodę analizy aktywnych związków kannabinoidowych zarówno w ciasteczkach brownies, jak i żelkach. Ekstrakcja QuEChERS do acetronitrylu była niebuforowana. Próbki gumijagód po ekstrakcji nie wymagały oczyszczania, podczas gdy ekstrakt z brownie został oczyszczony przez chłodzenie w celu usunięcia współekstrahowanych tłuszczów. Analizę kannabinoidów metodą HPLC-UV przeprowadzono na kolumnie Ascentis® Express Biphenyl o wielkości cząstek 2,7 µm, która zapewniła najlepszą separację wszystkich 11 związków w czasie poniżej 13 minut. Wartości odzysku dla żelków wyniosły ponad 90%, podczas gdy dla ciastek brownies wyniosły ponad 80%.

Przegląd sekcji

• Wprowadzenie
• Eksperyment: HPLC Analysis of Cannabinoids
• Extraction of Cannabinoids
• Wyniki i dyskusja
• Wnioski

Wprowadzenie

Analiza mocy marihuany w produktach spożywczych jest problematycznym zadaniem, przed którym stoją laboratoria analityczne ze względu na złożoność matryc. Do najpopularniejszych matryc należą cukierki gumowe i ciasteczka. Według jednego z laboratoriów, stężenie aktywnych kannabinoidów w produktach spożywczych może wynosić od kilku części na milion do 3,5 części na tysiąc.¹ W tym zastosowaniu opracowano procedurę ekstrakcji aktywnych związków kannabinoidowych z żelków i ciastek. Procedura obejmowała prostą i szybką ekstrakcję kannabinoidów z badanej żywności oraz analizę za pomocą HPLC-UV przy użyciu bifenylowej fazy stacjonarnej.

Experimental: HPLC Analysis of Cannabinoids

Do tego eksperymentu wykorzystano wzorce kannabinoidów firmy Cerilliant^® cannabinoid standards, dostępne w postaci roztworów o stężeniu 1 mg/ml w metanolu lub acetonitrylu. Stężenie kannabinoidów pozwoliło na wzbogacenie zarówno gumowatego ekstraktu, jak i ciastek na poziomie około 40 ppm wszystkimi związkami. W badaniu uwzględniono następujące związki: kwas kannabidiwarynowy (CBDVA), kannabidiwaryna (CBDV), kwas kannabigerolowy (CBGA), kannabigerol (CBG), kwas kannabidiolowy (CBDA), kannabidiol (CBD), tetrahydrokannabiwaryna (THCV), kannabinol (CBN), (-)-Δ⁹-Tetrahydrokannabinol (Δ⁹-THC), (-)-Δ⁸- Tetrahydrokannabinol (Δ⁸-THC) i (-)-Δ⁹-kwas tetrahydrokannabinolowy A (THCAA). Ta lista 11 różnych kannabinoidów obejmuje kilka form kwasowych; dlatego też zastosowano analizę HPLC w celu ilościowego oznaczenia ich w ich natywnych formach.

Zastosowano kolumnę HPLC Ascentis^® Express Biphenyl, o wielkości cząstek 2,7 µm, która zapewniła najlepszą separację wszystkich 11 związków w czasie poniżej 13 minut. Zastosowanie tej kolumny z Architektura cząstek Fused-Core^® spowodowała niskie ciśnienie wsteczne, dzięki czemu podczas tego eksperymentu można było użyć standardowego ciśnieniowego systemu HPLC.

Ekstrakcja kannabinoidów

Jeden cukierek żelkowy bez domieszki (2,3 g) rozpuszczono w 20 ml ciepłej wody. Roztwór ten został następnie wzbogacony kannabinoidami i wyekstrahowany przy użyciu procedury QuEChERS. Średni poziom w każdym gumowym misiu wynosił 45 ppm dla każdego związku. Testowano misie w czterech różnych kolorach - pomarańczowym, żółtym, czerwonym i zielonym. Po oznaczeniu, roztwór wody i cukierków został przeniesiony do 50 ml probówki wirówkowej z pokrywką. Dodano acetonitryl (10 ml), a probówkę wytrząsano ręcznie przez minutę. Dodano niebuforowane sole Supel™ QuE (55295-U), a próbki wytrząsano przez 5 minut na automatycznej wytrząsarce QuEChERS. Po wytrząsaniu próbki odwirowywano przez 5 minut przy 5000 obr. Górną warstwę zebrano i wstrzyknięto bezpośrednio do HPLC.

W przypadku ciastek, do probówki ekstrakcyjnej QuEChERS dodano 2,5 g próbki nieposypanego ciastka z lukrem. Próbka ta została wzbogacona kannabinoidami i pozostawiona na 30 minut przed ekstrakcją. Średni poziom kolców dla ciastek wynosił 40 ppm. Ekstrakcję QuEChERS przeprowadzono w sposób opisany wcześniej dla żelków. Po ekstrakcji górną warstwę acetonitrylu zebrano do fiolki i przechowywano w lodówce przez co najmniej 3 godziny w celu usunięcia tłuszczów przed analizą HPLC (Tabela 1).

Tabela 1. Warunki HPLC stosowane do oznaczania kannabinoidów w żelkach i ciastkach brownies.

Kolumna:	Ascentis® Express Biphenyl, 10 cm × 2,1 mm I. D., 2,7 µm (64065-U)
Faza ruchoma:	(A) 0,1% TFA w wodzie; (B) 0.1 % TFA w acetonitrylu
Gradient:	Przy 47 % B, do 50 % B w ciągu 13 minut, do 100 % B w ciągu 0.1 min, 100 % B przez 3 minuty, do 47 % B w 0,1 min, przy 47 % B przez 2,5 minuty
Prędkość przepływu:	0.70 mL/min
Column Temp.	35 °C
Detektor:	UV, 220 nm i 280 nm
Injection:	5 µL
Pressure:	340 bar
Instrument:	Agilent® 1200, z detektorem UV

Krzywą kalibracji skonstruowano w acetonitrylu, dopasowując oczekiwane stężenie 10 µg/ml w końcowych ekstraktach. Uwzględniono następujące punkty kalibracji: 2 µg/ml, 5 µg/ml, 10 µg/ml, 20 µg/ml i 25 µg/ml.

Wyniki i dyskusja

W przypadku próbek gumijagód stwierdzono, że ani czerwony, ani żółty, ani zielony kolor nie zakłócały wykrywania kannabinoidów przy 220 nm. Kolor czerwony został częściowo wyekstrahowany do acetonitrylu, podczas gdy kolory zielony i żółty pozostały w warstwie wodnej po ekstrakcji. Jednak pomarańczowy kolor z gumijagód, po ekstrakcji do acetonitrylu, miał zakłócający pik, który współwystępował z CBDVA. W związku z tym w przypadku pomarańczowej gumy do żucia oznaczanie ilościowe CBDVA przeprowadzono przy 280 nm, gdzie CBDVA ma znaczną absorbancję wolną od zakłóceń. Ilościowe oznaczenie przeprowadzono przy długości fali 220 nm dla pozostałych związków w tym badaniu (rysunek 1).

Rysunek 1. Chromatogram HPLC ekstraktu z gumijagód przy (a) 220 nm i (b) 280 nm Rysunek 2. Chromatogram HPLC ekstraktu Brownie przy 220 nm. Kolejność elucji pików podano w tabeli 1.

O ile w przypadku próbek gumijagód po ekstrakcji nie było wymagane czyszczenie, stwierdzono, że współekstrakty zawarte w brownie zmniejszają odzysk analitów, jeśli ekstrakt z brownie został wstrzyknięty do HPLC bez dalszego przetwarzania. Ekstrakt brownie został oczyszczony przez chłodzenie w celu usunięcia współekstrahowanych tłuszczów.

Wytrzymałość metody dla brownie została przetestowana przez wielokrotne wstrzyknięcie ekstraktu brownie (rysunek 2), a następnie wstrzyknięcie wzorca 10 µg / ml. Po 7 wstrzyknięciach ekstraktu brownie stwierdzono, że czasy retencji pików nie uległy zmianie, co wskazuje, że kolumna była dokładnie czyszczona między wstrzyknięciami. Obszary pików dla wzorców wykazały niewielki spadek o 4%.

Rysunek 2. HPLC ekstraktu Brownie przy 220 nm. Kolejność elucji pików podano w tabeli 1.

Doskonałe wartości odzysku wynoszące powyżej 90% dla żelków i powyżej 80% dla ciastek brownies zostały osiągnięte z dobrą dokładnością (Tabela 2).

Tabela 2. Powrót do zdrowia po spożyciu żelków i ciastek.

Peak No.	Compound	Yellow Gummy	Orange Gummy	Red Gummy	Average Gummy and RSD	Average Brownie and RSD
1	CBDVA	90 %	92 %*	92 %	91 % (2 %)	91 % (1 %)
2	CBDV	93 %	100 %	100 %	98 % (3 %)	93 % (5 %)
3	THCV	87 %	93 %	90 %	90 % (3 %)	87 % (1 %)
4	CBDA	94 %	90 %	95 %	94 % (3 %)	95 % (1 %)
5	CBGA	87 %	91 %	89 %	91 % (4 %)	90 % (2 %)
6	CBD	95 %	100 %	98 %	97 % (3 %)	89 % (5 %)
7	CBG	93 %	99 %	98 %	96 % (4 %)	91 % (5 %)
8	CBN	88 %	95 %	97 %	95 % (6 %)	84 % (4 %)
9	Delta-9-THC	93 %	99 %	100 %	97 % (3 %)	82 % (4 %)
10	Delta-8-THC	91 %	97 %	98 %	95 % (3 %)	80 % (4 %)
11	THCA-A	89 %	89 %	89 %	92 % (7 %)	91 % (2 %)

*Pomarańczowe żelki oznaczono przy 280 nm ze względu na zakłócające kwantyfikację piki tła.
Uwaga: THCA jest skrótem używanym przez AOAC

Conclusion

Opracowano metodę analizy aktywnych związków kannabinoidowych zarówno w brownies, jak i żelkach. Metoda ekstrakcji kannabinoidów obejmowała etap solenia do acetonitrylu i nie wymagała intensywnego oczyszczania. Rozdzielenie jedenastu związków zostało osiągnięte na bifenylowej fazie stacjonarnej HPLC i zostało zakończone w 13 minut.

Czytaj więcej na Cannabis Testing.

Odniesienie

1. Analytical 360, Test Results, Sour Gummy Bears. http:// analytical360.com/m/archived/216628, (accessed July 2016)..