Przepływ pracy dla analizy kannabinoidów w konopiach i produktach zawierających konopie

Sunil Badal, Senior Scientist¹, Uma Sreenivasan, Head of Reference Materials R&D¹

1-Round Rock, USA

Przygotowanie próbki

Standaryzacja i kalibracja

Chromatografia

Pomiar i analiza

Wprowadzenie: Analiza HPLC kannabinoidów w konopiach indyjskich i produktach konopnych

Legalizacja i używanie konopi, rekreacyjnych i medycznych konopi indyjskich rozszerza się na całym świecie. Kannabidiol (CBD) i tetrahydrokannabinol (THC) zawierające produkty z konopi indyjskich są spożywane w różnych formach, takich jak kwiaty, długopisy vape, produkty spożywcze, koncentraty, nalewki, napoje, produkty do stosowania miejscowego, kapsułki itp. Te produkty z konopi, CBD i marihuany muszą być testowane, aby zapewnić dokładne etykietowanie zawartości i bezpieczeństwo konsumentów. Badanie wykazało, że tylko 17% produktów jadalnych było dokładnie oznakowanych podczas testowania 75 różnych produktów jadalnych zawierających konopie indyjskie.¹ Ze względu na złożoność matryc produktów z konopi indyjskich, przygotowanie próbek do badań kannabinoidów jest bardzo trudne. Dokładne procedury ekstrakcji i analizy są wymagane w celu zapewnienia właściwej regulacji tych produktów. W tym badaniu zbadaliśmy proste i dokładne metody przygotowania próbek do analizy kannabinoidów z kilku matryc. 

Praca ta zapewnia kompletny przepływ pracy HPLC-PDA (wysokosprawna chromatografia cieczowa - matryca fotodiodowa) do analizy kannabinoidów przy użyciu:

• Szczegółowe przygotowanie próbek pąków konopi, oleju konopnego, czekolady, gumy, cukierków i kremu.
• Demonstracja dwóch metod HPLC w celu oddzielenia siedemnastu kannabinoidów; jedna oparta na acetonitrylu jako modyfikatorze organicznym i kolumnie Ascentis^® Express C18; druga oparta na metanolu jako modyfikatorze organicznym i kolumnie Ascentis^® Express C8.
• Przygotowanie krzywej kalibracyjnej przy użyciu certyfikowanych materiałów referencyjnych (CRM).
• Testowanie siły działania kannabinoidów w różnych matrycach.

Struktura chemiczna 17 kannabinoidów

Kannabinoidy to związki występujące w konopiach indyjskich lub związki syntetyczne, które mogą wchodzić w interakcje z układem endokannabinoidowym. Istnieje ponad 100 różnych kannabinoidów, które zostały wyizolowane z konopi indyjskich. Wiele z tych kannabinoidów to izomery lub związki o bardzo podobnej strukturze. Delta9-tetrahydrokannabinol (∆9-THC) jest najbardziej znaczącym głównym związkiem psychoaktywnym, a kannabidiol (CBD) jest kolejnym głównym niepsychoaktywnym składnikiem konopi indyjskich. Struktury ∆9-THC, CBD i niektórych innych kannabinoidów analizowanych opisywaną tu metodą przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1. Struktury chemiczne siedemnastu kannabinoidów analizowanych w tym badaniu.

Przygotowanie fazy ruchomej HPLC

W niniejszym badaniu przedstawiono dwie oddzielne metody HPLC. Instrukcje przygotowania fazy ruchomej dla obu metod są wymienione w Tabeli 1 poniżej.

Tabela 1. Instrukcje dotyczące przygotowania fazy ruchomej

	Faza ruchoma	Instrukcje
Metoda szybkiego gradientu acetonitrylu
	5 mM mrówczan amonu + 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie	Dodaj 1 mL kwasu mrówkowego do 1 L wody. Alternatywnie, użyj wstępnie przygotowanego 0,1% wodnego roztworu kwasu mrówkowego. Dodaj 315,3 mg mrówczanu amonu do 0,1% roztworu kwasu mrówkowego (aq.) i dobrze wymieszaj.
	0.1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu	Dodaj 1 mL kwasu mrówkowego do 1 L acetonitrylu. Alternatywnie, użyj preformułowanego 0,1% roztworu acetonitrylu kwasu mrówkowego.
.Tania metoda metanolowa
	0.1% kwasu mrówkowego w wodzie	Dodaj 1 mL kwasu mrówkowego do 1 L wody. Alternatywnie, użyj gotowego 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie.
	0.06% kwasu mrówkowego w metanolu	Dodaj 1 mL kwasu mrówkowego do 1 L metanolu.

Przygotowanie identyfikacji pików i roztworów kalibracyjnych

Roztwory kalibracyjne dla 17 mieszanin kannabinoidów przygotowano z certyfikowanych materiałów referencyjnych (CRM), jak opisano w Tabeli 2 poniżej.

Tabela 2. Instrukcje przygotowania roztworów do identyfikacji pików i kalibracji.

Kroki	Instrukcje
1.	Do 1.5 ml fiolki z autosamplerem dodać następujące objętości roztworów CRM w celu przygotowania roztworu podstawowego:
	#	Cannabinoid	Cat. No.	Conc. (mg/ml)	Objętość (µL)
	1	Mieszanina kannabinoidów (neutralna)	C-219	0.5	200
	2	Mieszanina kannabinoidów (kwasy)	C-218	0.5	200
	3	CBLA	C-171	0.5	200
	4	CBNA	C-153	1.0	100
	5	CBL	C-154	1.0	100
2.	Dodaj 200 µL metanolu i dobrze wymieszaj. Końcowe stężenie wynosi 100 µg/ml dla wszystkich 17 kannabinoidów.
3.	Przygotuj roztwór dla 6-punktowej krzywej kalibracyjnej zgodnie z poniższym schematem rozcieńczania, używając metanolu jako rozcieńczalnika:
	Conc. (µg/mL)		Identyfikator roztworu	Współczynnik rozcieńczenia	Roztwór źródłowy
	100		A	1	Stock
	25		B	4	Stock
	5		C	5	B
	1		D	5	C
	0.5		E	2	D
	0.25		F	2	E
4.	Ponieważ wszystkie te roztwory zawierają 17 kannabinoidów, jeden z nich może być użyty do identyfikacji piku.

Parametry rozwoju metody HPLC

Dwie oddzielne metody HPLC-PDA zostały przetestowane pod kątem separacji 17 kannabinoidów. Metoda szybkiego gradientu acetonitrylu oparta jest na kolumnie Ascentis^® Express C18 z acetonitrylem jako modyfikatorem organicznym, podczas gdy metoda niskokosztowego metanolu oparta jest na kolumnie Ascentis^® Express C8 z metanolem jako modyfikatorem organicznym. Szczegóły wszystkich parametrów HPLC podsumowano w Tabeli 3 i Tabeli 4 poniżej.

Tabela 3. Parametry metody dla metody szybkiego gradientu acetonitrylu.

Parametry HPLC	Metoda szybkiego gradientu acetonitrylu
Instrument:	Shimadzu LC-30 z detektorem SPD-M20A PDA
Kolumna:	Ascentis® Express C18 150 x 3.0 mm, 2.7 µm (53816-U)
Faza ruchoma:	[A] 5 mM mrówczan amonu w 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie [B] 0.1% kwas mrówkowy w acetonitrylu
Gradient:	Czas (min)	%A	%B
	0	30	70
	2	18	82
	7	18	82
	7.1	30	70
	10	30	70
Przepływ:	0.8 mL/min
Maks. ciśnienie:	260 barów
Temperatura kolumny:	25 °C
Detekcja:	UV, 228 nm
Objętość wtrysku:	5 µL

Tabela 4. Parametry metody dla taniej metody metanolowej.

.Parametry HPLC	Niskokosztowa metoda metanolowa
Instrument:	Shimadzu LC-30 z detektorem SPD-M20A PDA
Kolumna:	Ascentis® Express C8 50 x 2.1 mm (2.7 µm)  (53831-U)
Temperatura kolumny:	45 °C
Faza ruchoma:	[A]: 0,1% kwas mrówkowy w wodzie [B]: 0.06% kwasu mrówkowego w metanolu
Gradient:	Czas (min)	%A	.%B
	0	40	60
	10	25	75
	12	20	80
	12.1	40	60
	14	40	60
Flow:	0.6 mL/min
Objętość iniekcji:	1 µL
Detekcja:	228 nm
Maks. ciśnienie:	140 bar

Przygotowanie próbki pąków konopi

Próbka pąków konopi musi zostać zmielona na małe cząstki, aby zapewnić maksymalną liczbę kannabinoidów do ekstrakcji. Ten etap homogenizacji jest prawdopodobnie największym wyzwaniem, jeśli nie jest dostępny odpowiedni sprzęt do homogenizacji. Homogenizacja w niskiej temperaturze, taka jak zamrożone mielenie kulowe, jest preferowaną metodą homogenizacji bez degradacji próbki. Jednakże, młynek kriogeniczny, jak sugeruje ten artykuł, może być używany jako alternatywa dla eksperymentów na małą skalę. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki pąków konopi opisano poniżej:

1. Homogenizuj próbkę pąków konopi za pomocą młynka kriokubkowego lub innego odpowiedniego procesu mielenia zamrożonych kulek.
2. Dokładnie zważ 0,5±0.01 g zhomogenizowanej próbki i przenieś ją do 50 ml polipropylenowej probówki wirówkowej.
3. Dozuj 20 ml etanolu do probówki i worteksuj przez 1 minutę, a następnie inkubuj na poziomej wytrząsarce przez 30 minut.
4. Wiruj próbkę przy 4000 obr / min przez 5 minut, aby osuszyć materiał roślinny.
5. Wlać supernatant do 50 ml bursztynowej kolby miarowej i odstawić na bok do drugiej ekstrakcji.
6. Przeprowadź drugą ekstrakcję materiału 20 ml etanolu i ekstrahuj do 50 ml bursztynowej kolby miarowej zawierającej zawartość pierwszej ekstrakcji.
7. Napełnij kolbę etanolem do kreski i dobrze wymieszaj.
8. Przefiltruj próbkę bezpośrednio do fiolki HPLC z membraną PTFE 0,2 µm do analizy.
9. Wykonaj rozcieńczenie próbki metanolem w stosunku 1:10 i 1:100 (Należy pamiętać, że poziom rozcieńczenia można dostosować tak, aby mieścił się w krzywej kalibracji. W celu ilościowego oznaczenia różnych kannabinoidów konieczne może być zastosowanie różnych poziomów rozcieńczenia. W razie potrzeby przeprowadź analizę przesiewową z rozcieńczeniem 1:10, 1:100 i 1:1000).

Rysunek 2. Proces przygotowania próbki dla pąków konopi.

Przygotowanie próbki oleju konopnego

Ponieważ olej konopny łatwo rozpuszcza się w odpowiednich rozpuszczalnikach, przygotowanie próbki oleju konopnego jest stosunkowo proste. Próbka oleju konopnego jest najpierw mieszana w odpowiedniej objętości izopropanolu, a następnie rozcieńczana w metanolu. Instrukcje krok po kroku podano poniżej:

1. Zważ 10 µL próbki oleju konopnego w fiolce autosamplera. Zapisz masę. (Jeśli dokładne zważenie 10 µL nie jest możliwe, postępuj zgodnie z alternatywną metodą opisaną poniżej w notatce)
2. Dodaj 495 µL izopropanolu (IPA) i dobrze wymieszaj worteksem przez 1 minutę. 
3. Dodaj 495 µL metanolu i dobrze wymieszaj worteksem przez 1 minutę (końcowe rozcieńczenie 100X).
4. Użyj tego roztworu do analizy wszystkich pomniejszych kannabinoidów z wyjątkiem CBD.
5. Przeprowadź rozcieńczenie metanolem w stosunku 1:10 w celu oznaczenia ilościowego CBD.

Uwaga: Do oznaczenia ilościowego różnych kannabinoidów może być konieczne użycie różnych poziomów rozcieńczenia. Jeśli dokładne ważenie nie jest możliwe dla próbki oleju konopnego o objętości 10 µL, do analizy można użyć większej ilości próbki, a objętości rozpuszczalników należy odpowiednio zwiększyć. Na przykład, 50 µL oleju konopnego można wymieszać w 5 ml izopropanolu w kolbie miarowej o pojemności 10 ml, a następnie uzupełnić do kreski metanolem, po czym odpowiednio rozcieńczyć.

Przygotowanie próbki czekolady

Próbki czekolady nie rozpuszczają się łatwo w rozpuszczalnikach metanolu lub acetonitrylu (ACN). Próbka musi zostać rozpuszczona w wodzie, aby doprowadzić ją do roztworu, a następnie wyekstrahowana do fazy organicznej przy użyciu etapu ekstrakcji techniki QuEChERS.² Sole w procesie ekstrakcji QuEChERS skutecznie wymuszają oddzielenie ACN od warstwy wodnej. Cukry pozostają rozpuszczone w fazie wodnej, podczas gdy niektóre lipidy są nadal zatrzymywane w fazie organicznej. Jeśli ekstrakt z lipidami zostanie wstrzyknięty bez dalszej obróbki, znacznie skróci to żywotność kolumny. Dlatego w celu przygotowania końcowego ekstraktu należy wykonać techniki takie jak zimowanie. Poniżej przedstawiono instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbek czekolady do badania siły działania kannabinoidów:

1. Rozpuścić 1 g próbki czekolady w 15 ml ciepłej wody (~75 °C) w 50 ml probówce wirówkowej. 
2. Dodaj 15 ml ACN i wstrząsaj ręcznie przez 10 s.
3. Dodaj niebuforowaną mieszaninę soli QuEChERS (4 g MgSO4 i 1 g NaCl) i wstrząsaj w automatycznej wytrząsarce przez 5 minut.
4. Wiruj z prędkością 4300 RPM przez 5 minut.
5. Odciągnij górną warstwę (15 ml) do analizy HPLC/UV.
6. Przechowuj ekstrakt w temperaturze -20 °C przez 30 minut w celu zimowania i odwiruj przy 4000 RPM przez 2 minuty. Alternatywnie, przechowywać ekstrakt w lodówce przez ~ 3 godziny w celu zimowania w przypadku, gdy zamrażarka -20 °C nie jest dostępna i odwirować.
7. Wirować przez 2 minuty i pobrać górną warstwę.
8. Przefiltruj próbkę bezpośrednio do fiolki HPLC z membraną PTFE 0,2 µm do analizy.
9. Wykonaj rozcieńczenia próbki metanolem w stosunku 1:10, 1:100 i 1:1000. (Należy pamiętać, że poziom rozcieńczenia można dostosować tak, aby mieścił się w krzywej kalibracji. W celu ilościowego oznaczenia różnych kannabinoidów konieczne może być zastosowanie różnych poziomów rozcieńczenia. W razie potrzeby przeprowadź analizę przesiewową z rozcieńczeniami 1:10, 1:100 i 1:1000).

Rysunek 3. Proces przygotowania próbki czekolady.

Przygotowanie próbek gumy do żucia

Przygotowanie próbek gumy do żucia jest podobne do przygotowania czekolady, ale niekoniecznie wymaga etapu zimowania, ponieważ próbki gumy do żucia zazwyczaj nie zawierają lipidów. Podobnie jak czekolada, próbki żelków również nie rozpuszczają się w metanolu i muszą być najpierw rozpuszczone w wodzie, a następnie poddane procesowi ekstrakcji QuEChERS. Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbek żelków znajdują się poniżej.

Rysunek 4. Proces przygotowania próbki gumowatej.

1. Zapisać wagę jednej żelki. Rozpuść jedną żelkę w 25 ml ciepłej wody w 50 ml probówce wirówkowej. (Uwaga: Ponieważ jeden żelki ma zwykle ~5-6 g, potrzebuje więcej wody do rozpuszczenia. Próbkę gumy można pociąć na kawałki, aby przyspieszyć rozpuszczanie.
2. Dodaj 15 ml ACN i wstrząsaj ręcznie przez 10 sekund.
3. Dodaj niebuforowaną sól QuEChERS (4 g MgSO4 i 1 g NaCl) i wstrząsaj w automatycznej wytrząsarce przez 5 minut.
4. Wiruj z prędkością 4300 RPM przez 5 minut.
5. Odciągnij górną warstwę (15 ml) do analizy HPLC/UV.
6. Przefiltruj próbkę bezpośrednio do fiolki HPLC z membraną PTFE 0,2 µm do analizy.
7. Wykonaj rozcieńczenia próbki metanolem w stosunku 1:10 i 1:100. (Należy pamiętać, że poziom rozcieńczenia można dostosować tak, aby mieścił się w krzywej kalibracji. W celu ilościowego oznaczenia różnych kannabinoidów może być konieczne zastosowanie różnych poziomów rozcieńczenia. W razie potrzeby przeprowadź analizę przesiewową z rozcieńczeniami 1:10, 1:100 i 1:1000).

Przygotowanie próbki dla cukierków

Przygotowanie próbki dla twardych cukierków jest podobne jak w przypadku żelków i również nie wymaga zimowania. Cukierki można połamać na małe kawałki, aby przyspieszyć rozpuszczanie w wodzie. Ponadto, mniejszy rozmiar próbki (1-2 g) może być użyty do rozpuszczenia w 15 ml wody lub cały cukierek (4-6 g) może być rozpuszczony w 25 ml wody w pierwszym etapie.

Przygotowanie próbki kremu

Kannabinoidy z próbki kremu mogą być ekstrahowane do rozpuszczalnika przez worteksowanie i sonikację stopionej próbki zanurzonej w rozpuszczalniku ekstrakcyjnym. Poniżej znajdują się instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki kremu:

1. Odważ 1 g kremu w szklanej fiolce o pojemności 20 ml i zapisz dokładną wagę.
2. Ogrzej ją w łaźni wodnej, aby stała się płynna.
3. Dodaj 10 ml metanolu i worteksuj przez 1 minutę.
4. Sonicate przez 5 minut. Następnie wszystkie kannabinoidy powinny zostać wyekstrahowane do metanolu.
5. Filtruj przez filtr PTFE 0,2 µm.
6. Rozcieńcz 1:10 i 1:100 metanolem do analizy.

Wyniki i dyskusja

Przydatność systemu: Rozwiązania do identyfikacji pików

Opracowano dwie oddzielne metody HPLC-PDA do rozdzielania mieszanin 17 kannabinoidów. Chromatogramy przedstawiające rozdzielenie 17 mieszanin kannabinoidów każdą z metod przedstawiono na Rysunku 5 i Rysunku 6. Należy zauważyć, że kolejność elucji jest inna dla każdej metody. W przypadku metody acetonitrylowej z szybkim gradientem wszystkie 17 analitów eluuje się w ciągu 8 minut, podczas gdy tania metoda metanolowa zajmuje 12 minut. Obliczenia kosztów sugerują, że niskokosztowa metoda metanolowa może zaoszczędzić 40 USD na wstrzyknięciu w porównaniu z metodą acetonitrylową.³ Pozostałe dane przedstawione tutaj dotyczą metody acetonitrylowej, jednak metoda metanolowa jest przedstawiona jako alternatywa i może być stosowana, jeśli zanieczyszczenia współwystępują z analitem będącym przedmiotem zainteresowania. Ponieważ kolejność elucji jest różna, zanieczyszczenia pokrywające się z analitami w jednej metodzie mogą oddzielić się w innej metodzie. Zależy to od indywidualnych eksperymentów.  

Rysunek 5. Chromatogram dla 17 mieszanek kannabinoidów uzyskany metodą szybkiego gradientu acetonitrylu.

Rysunek 6. Chromatogram dla 17 mieszanek kannabinoidów uzyskanych przy użyciu taniej metody metanolowej.

Krzywe kalibracji

Rysunek 7. Sześciopunktowe krzywe kalibracyjne uzyskane metodą szybkiego gradientu acetonitrylu dla 17 kannabinoidów w zakresie 0,25-100 µg/ml. Podobne krzywe kalibracyjne uzyskano metodą metanolową.

Kwantyfikacja

Następujący wzór jest używany do obliczania stężenia kannabinoidów:

Gdzie,

Df = współczynnik rozcieńczenia po ekstrakcji
Fv = końcowa objętość ekstrakcji (ml)

Aby przeliczyć mg/g na procent wagowy, wynik jest dzielony przez 1000 i mnożony przez 100:

Stężenie kannabinoidów (%) = (Stężenie kannabinoidów (mg/g)/1000) * 100

Moc kannabinoidów w pąkach konopi

Moc kannabinoidów w pąkach konopi musi być podawana na podstawie suchej masy próbki. W tym przypadku zawartość wilgoci określono za pomocą miareczkowania Karla Fischera (KF, kulometria) i stwierdzono, że wynosi ona 8,175%. Szczegółowy opis metody KF można znaleźć w innym miejscu.⁴ Stężenie kannabinoidów określone metodą szybkiego gradientu acetonitrylu podano poniżej na Rysunku 8 i Tabeli 5 jako przykład. Podobne wyniki uzyskano również w metodzie metanolowej (nie podano ich tutaj). Końcowy ekstrakt uzyskany z przygotowania próbki rozcieńczono 1:10 i 1:100 razy. Wszystkie trzy poziomy rozcieńczenia wykorzystano do ilościowego określenia stężenia kannabinoidów. Na przykład, stężenie CBGA jest określane na podstawie poziomu rozcieńczenia 1:100, a ∆9-THC jest określane na podstawie wstrzyknięcia czystego roztworu ekstraktu. Tabela 5 pokazuje siłę działania kannabinoidów w stanie obecnym (mokrym) oraz w przeliczeniu na suchą masę.

Rysunek 8. Wykres kołowy przedstawiający oznaczone stężenia kannabinoidów w próbce pąka konopi przy użyciu metody szybkiego gradientu acetonitrylu.

Tabela 5. Stężenie kannabinoidów w próbce pąków konopi oznaczono za pomocą analizy HPLC-PDA przy użyciu metody szybkiego gradientu acetonitrylu. Suchą masę określono na podstawie zawartości wilgoci wynoszącej 8,175%.

Kannabinoidy	Wet wt%	Dry wt%
∆9-THC	0.049	0.054
CBC	0.181	0.193
CBCA	0.316	0.344
CBG	1.176	1.280
CBGA	10.172	11.078
THCA	0.052	0.056

Potencjał kannabinoidów w oleju konopnym

Próbkę oleju konopnego przygotowano zgodnie z opisem w sekcji przygotowania próbki, a roztwór podstawowy rozcieńczono metanolem w stosunku 1:10. Zarówno rozcieńczone, jak i nierozcieńczone roztwory podstawowe analizowano za pomocą HPLC-PDA. Próbka oleju konopnego zawierała sześć kannabinoidów, w tym CBDV, CBG, CBD, CBN, ∆9-THC i CBC. Wszystkie stężenia kannabinoidów mieściły się w krzywej kalibracji z pierwszym nierozcieńczonym roztworem podstawowym, z wyjątkiem CBD. Stężenie CBD mieściło się w krzywej kalibracji z rozcieńczonym roztworem 1:10. Ilościowanie przeprowadzono przy odpowiednich poziomach rozcieńczenia, a wyniki podano w Tabeli 6. 

Tabela 6. Stężenie kannabinoidów w próbce oleju konopnego oznaczono za pomocą analizy HPLC-PDA przy użyciu metody szybkiego gradientu acetonitrylu.

Kannabinoid	Aliquot 1 (mg/g)	Aliquot 2 (mg/g)	Aliquot 3 (mg/g)	Avg (mg/g)	STDEV (mg/g)	%RSD
CBDV	2.088	2.096	2.143	2.109	0.030	1.414
CBG	0.862	0.877	0.887	0.875	0.013	1.484
CBD	126.246	124.984	127.340	126.190	1.179	0.934
CBN	0.467	0.468	0.489	0.475	0.012	2.570
∆9-THC	2.907	2.885	2.985	2.926	0.053	1.803
CBC	7.719	8.238	8.464	8.141	0.382	4.693

Potencjał kannabinoidowy w próbce gumy do żucia

Końcowy ekstrakt próbki gumy do żucia rozcieńczono metanolem w stosunku 1:20. Rozcieńczona próbka została użyta do ilościowego oznaczenia stężenia CBD, jak pokazano w Tabeli 7 poniżej.

Tabela 7. Stężenie CBD w próbce gumy do żucia, określone za pomocą analizy HPLC-PDA przy użyciu metody szybkiego gradientu acetonitrylu.

Kannabinoid	Aliquot 1 (mg/g)	Aliquot 2 (mg/g)	Aliquot 3 (mg/g)	Średnia (mg/g)	STDEV (mg/g)	%RSD
CBD	2.274	2.093	2.255	2.207	0.100	4.5

Stężenie kannabinoidów w czekoladzie

Końcowy ekstrakt próbki czekolady rozcieńczono metanolem w stosunku 1:20. Oba poziomy rozcieńczenia wykorzystano do ilościowego oznaczenia stężenia kannabinoidów. Wykryto cztery kannabinoidy powyżej LOQ. Wyniki podsumowano w Tabeli 8. Niski procent RSD dla określonych wartości z różnych podwielokrotności sugeruje, że metoda przygotowania próbki ma dobrą powtarzalność.

Tabela 8. Stężenia kannabinoidów określone w próbce czekolady przy użyciu metody metanolowej.

Kannabinoid	Aliquot 1 (mg/g)	Aliquot 2 (mg/g)	Aliquot 3 (mg/g)	Avg (mg/g)	STDEV (mg/g)	%RSD
CBC	0.053	0,053	0,054	0,053	0.001	1.6
CBD	4.145	4.166	4.086	4.132	0.042	1.0
CBG	0.009	0.009	0.009	0.009	0.000	2.2
CBN	0.032	0.032	0.033	0.032	0.000	1.3

Potencjał kannabinoidowy w cukierkach

Końcowy ekstrakt próbki cukierków rozcieńczono metanolem w stosunku 1:20. Rozcieńczona próbka została użyta do ilościowego oznaczenia stężenia CBD, jak pokazano w Tabeli 9 poniżej.

Tabela 9. Stężenie CBD oznaczone w próbce cukierków przy użyciu metody metanolowej.

Próbka twardych cukierków	CBD (mg/g)
Aliquot 1	6.170
Aliquot 2	5.886
Aliquot 3	5.614
Średnia	5.890
STDEV	0.278
%RSD	4.716

Potencjał kannabinoidów w kremie

Poddano analizie trzy podwielokrotności próbki kremu. Wyniki są wymienione w Tabeli 10. Średnie stężenie CBD określono na 21,973 mg/g przy % RSD wynoszącym 5,4 (n=3).

Tabela 10. Stężenie CBD w matrycy kremu oznaczane metodą szybkiego gradientu acetonitrylu

Próbka kremu	CBD (mg/g)
Aliquot 1	21.572
Aliquot 2	21.029
Aliquot 3	23.318
Średnia	21.973
STDEV	1.196
%RSD	5.443

Analiza widm UV

Identyfikacja analitów w analizie HPLC-UV zależy od czasów retencji i może być zagrożona przez współwystępujące piki. Aby upewnić się, że żadne zanieczyszczenie nie współwystępuje z pikiem zainteresowania lub aby uniknąć błędnej identyfikacji z powodu tych samych czasów retencji obcych analitów, porównaliśmy widma absorpcji UV analitów z widmami wzorców. Ta analiza widm absorpcji UV zminimalizowała wpływ zanieczyszczeń. Na przykład w ekstrakcie z czekolady wystąpił pik w czasie retencji CBDA, ale widmo absorpcji UV nie odpowiadało widmu wzorca CBDA i dlatego zostało wyeliminowane z raportowania jako CBDA. Na Rysunku 9 pokazano przykłady pasujących i niepasujących widm wzorców z podejrzanymi pikami. Analiza widm absorpcji UV została przeprowadzona dla każdego typu próbki w celu wyeliminowania takich błędnych identyfikacji.

Rysunek 9. Nałożenie widm absorpcji UV podejrzanych pików CBDA (A) i CBD (B) z ekstraktu czekolady z widmami wzorców. A) Pokazuje, że podejrzane CBDA nie ma pasujących widm ze standardem, podczas gdy B) pokazuje, że podejrzane CBD ma pasujące widma ze standardem (fioletowa linia nie jest widoczna z powodu nakładania się).

Wnioski

Zademonstrowano przygotowanie próbek do analizy kannabinoidów z kilku matryc, takich jak pączki konopi, olej konopny, żelki, cukierki, czekolada i śmietana. Do ilościowego oznaczania kannabinoidów zastosowano dwie metody HPLC-PDA oparte na kolumnach Ascentis^® Express C18 i C8; jedną opartą na acetonitrylu, a drugą na metanolu jako modyfikatorze organicznym. Metoda szybkiego gradientu acetonitrylu jest szybsza. Z drugiej strony, metoda metanolowa jest bardziej opłacalna w przeliczeniu na jedno wstrzyknięcie w porównaniu z metodą acetonitrylową. Określenie siły działania kannabinoidów dla pąków konopi na podstawie suchej masy próbki uzyskano poprzez określenie zawartości wilgoci metodą miareczkowania Karla Fischera (kulometria). Omówiono również analizę widma absorpcji UV w celu uniknięcia błędnej identyfikacji lub zminimalizowania wpływu współwystępujących zanieczyszczeń.

Zobacz więcej informacji na temat naszej oferty na stronie:

• Testowanie potencji konopi: opracowanie metody i rozważania dotyczące kosztów
• Oznaczanie zawartości wody w konopiach indyjskich i konopiach metodą miareczkowania Karla Fischera

Referencje

1. Vandrey R, Raber JC, Raber ME, Douglass B, Miller C, Bonn-Miller MO. 2015. Cannabinoid Dose and Label Accuracy in Edible Medical Cannabis Products. JAMA. 313(24):2491. https://doi.org/10.1001/jama.2015.6613

2. Anastassiades M, Lehotay SJ, Štajnbaher D, Schenck FJ. 2003. Fast and Easy Multiresidue Method Employing Acetonitrile Extraction/Partitioning and "Dispersive Solid-Phase Extraction" for the Determination of Pesticide Residues in Produce. 86(2):412-431. https://doi.org/10.1093/jaoac/86.2.412

3. Brandes H. 2022. Cannabis Potency testing: method development and cost considerations. [Internet]. SigmaAldrich.com.[cited 21 Sep 2022]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/technical-article/environmental-testing-and-industrial-hygiene/cannabis-testing/cannabis-potency-testing

4. Piper A, Herzig B, Straub-Jubb B. 2022. Determination of water in cannabis and hemp by Karl Fischer Titration. [Internet]. SigmaAldrich.com.[cited 21 Sep 2022]. Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocol/analytical-chemistry/titration-and-karl-fischer/determination-water-content-in-cannabis-hemp