Analiza 17 kannabinoidów w konopiach i marihuanie

Przegląd sekcji

• Wprowadzenie: Analiza kannabinoidów w marihuanie i konopiach pod kątem siły działania
• Przygotowanie próbek roztworów standardowych, roztworu do identyfikacji pików i ekstraktu z konopi
• Preparation of Peak Identification Solution
• Chromatography
• 5.0 Wnioski: Dokładna analiza kannabinoidów przy użyciu HPLC
• Produkty powiązane
• literatura

Przebieg analizy kannabinoidów w konopiach i marihuanie

Wprowadzenie: Analiza kannabinoidów w marihuanie i konopiach pod kątem mocy

Wiele krajów na całym świecie zaczęło legalizować rekreacyjną i leczniczą marihuanę. W Stanach Zjednoczonych wymagane jest testowanie mocy kannabinoidów w konopiach indyjskich i produktach z konopi. Roślina konopi zawiera ponad 100 różnych kannabinoidów, a najbardziej rozpowszechnionymi kannabinoidami są delta-9-tetrahydrokannabinol (THC) i kannabidiol (CBD). Rosnące zainteresowanie korzyściami terapeutycznymi płynącymi z mniejszych kannabinoidów zwiększyło zapotrzebowanie na metody analityczne zdolne do oddzielenia 17 kannabinoidów. Kannabinoidy przeznaczone do testowania składały się z tych wymienionych przez AOAC w standardowych wymaganiach dotyczących wydajności metod (SMPR) dla suszonego materiału roślinnego (odmiany o niskiej i wysokiej zawartości THC), czekolad i koncentratów, a także trzech dodatkowych interesujących kannabinoidów.

Oznaczanie ilościowe kannabinoidów można przeprowadzić przy użyciu różnych technik analitycznych, takich jak wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC), chromatografia gazowa (GC) lub spektrometria mas.

Opracowano kompletny przepływ pracy HPLC w celu uproszczenia profilowania kannabinoidów i określania siły działania. Ten przepływ pracy oferuje następujące funkcje:

• Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki i analizy 17 kannabinoidów
• Szybka metoda gradientowa o wysokiej rozdzielczości: 6 minut na kolumnie C18 (2 µm)
  
• Szybka metoda gradientowa: 6 minut na kolumnie C18 (2,7 µm)
• Niskociśnieniowa metoda izokratyczna: 8 minut na kolumnie C8 (2.7 µm)
• Niskie natężenie przepływu w celu zmniejszenia zużycia rozpuszczalnika  
• Kompatybilność ze spektrometrią mas

Ortogonalna analiza szczepu konopi o wysokiej zawartości CBD została przeprowadzona przy użyciu dwóch różnych faz stacjonarnych. Poniższe instrukcje zostały wykorzystane do przygotowania ekstraktu z konopi i roztworów wzorcowych do oznaczania ilościowego kannabinoidów. Niskociśnieniowa metoda izokratyczna i szybka metoda wysokiej rozdzielczości zostały wybrane do określenia mocy (całkowitej zawartości THC i CBD) kwiatu konopi.

Struktura chemiczna 17 kannabinoidów

Przygotowanie próbek roztworów standardowych, roztworu do identyfikacji pików i ekstraktu z konopi

Przygotowanie ekstraktu z kwiatów konopi

Krok	Przygotowanie ekstraktu z kwiatów konopi<
1	Homogenizuj 5 g kwiatu konopi (wielkość cząstek ≤ 1 mm). Uwaga: Mrożone mielenie kulowe jest preferowaną metodą homogenizacji bez degradacji próbki. Homogenizacja w niskiej temperaturze zapobiega degradacji analitów i zapewnia jednorodne rozmiary cząstek. Istotne jest, aby protokół pobierania próbek był zgodny z lokalnymi wytycznymi i zapewniał dokładną reprezentację materiału sypkiego. (Patrz: Wytyczne dla stanowych programów testowania medycznej marihuany)
2	Oważ 0,5 ±0.01 g na skalibrowanej mikrowadze i przenieś próbkę do 50 ml polipropylenowej probówki wirówkowej
3	Dozuj 20 ml etanolu do probówki i krótko worteksuj, inkubuj próbkę na poziomej wytrząsarce przez 30 minut przy 250 obr.
4	Wiruj próbkę z prędkością 4000 obrotów na minutę przez 5 minut w celu osuszenia materiału roślinnego.
5	Ostrożnie przelej supernatant do bursztynowej kolby pomiarowej o pojemności 50 ml i odstaw na bok do drugiej ekstrakcji.
6	Przeprowadź drugą ekstrakcję materiału przy użyciu 20 ml etanolu i dodaj ekstrakt do bursztynowej kolby miarowej o pojemności 50 ml zawierającej zawartość pierwszej ekstrakcji.
7	Napełnij kolbę do kreski etanolem i dobrze wymieszaj.
8	Przeprowadź rozcieńczenie próbki 1:10 i 1:100 rozcieńczenie próbki metanolem
9	Przefiltruj próbki bezpośrednio do fiolek HPLC z membraną PTFE 0.2 µM membraną PTFE Uwaga: Filtrowanie próbek można przeprowadzić za pomocą filtra strzykawkowego Millex lub systemu filtracji Samplicity G2 do zastosowań o wysokiej przepustowości.

Przygotowanie faz ruchomych

Faza ruchoma	Instrukcje
5 mM mrówczan amonu + 0.1% kwas mrówkowy	1. Przygotuj 0,1% kwas mrówkowy dodając 1 ml kwasu mrówkowego do 1 l wody, dobrze wymieszaj. Alternatywnie można użyć wstępnie przygotowanego 0,1% wodnego roztworu kwasu mrówkowego 2. Dodaj 315,3 mg mrówczanu amonu do 0,1% kwasu mrówkowego i dobrze wymieszaj.
0.1% kwasu mrówkowego w acetonitrylu	Dodaj 1 ml kwasu mrówkowego do 1 litra acetonitrylu i dobrze wymieszaj. Alternatywnie można użyć wstępnie przygotowanego 0,1% roztworu acetonitrylu z kwasem mrówkowym.

Przygotowanie roztworów standardowych

Krok	Instrukcje
1	Do bursztynowej kolby pomiarowej o pojemności 10 ml dodaj 1 ml następujących CRM:
	#	Kannabinoid	Numer produktu	mg/mL
	1	CBDA	C-144	1.0
	2	THCA	T-093	1.0
	3	CBG	C-141	1.0
	4	CBD	C-045	1.0
	5	CBN	C-046	1.0
	6	∆9-THC	T-005	1.0
2	Napełnij do kreski metanolem i dobrze wstrząśnij, aby uzyskać końcowy roztwór 100 µg/ml każdego analitu.
3	Wykonaj następujący schemat rozcieńczania, aby uzyskać 6-punktową krzywą kalibracyjną:
		µg/ml	Współczynnik rozcieńczenia
		100	1
		25	4
		5	5
		1	5
		0.5	2
		0.25	2
	Uwaga: Roztwory wzorcowe mogą być również przygotowywane grawimetrycznie w celu poprawy dokładności i zmniejszenia zmienności między partiami.

Przygotowanie roztworu do identyfikacji pików

Krok	Instrukcje						.th>Instrukcje
1	Zmieszaj następujące CRM z przypisaną objętością w 1.5 ml fiolce z autosamplerem.
	# CRM z przypisaną objętością w fiolce autosamplera 1,5 mL./tr>
	#	Kannabinoid	Numer produktu	mg/mL	Objętość
	1./tr>
	1	Mieszanina kannabinoidów (substancje neutralne)	C-219	0.5	100
2	Mieszanina kannabinoidów (kwasy)	C-218	0.5	100
3	CBLA	C-171	0.5	50
4	CBNA	C-153	1.0	50
5	CBL	C-154	1.0	50
2	Dodaj 650 μL metanolu i dobrze wymieszaj do końcowego stężenia 50 μg/mL dla każdego analitu (25 μg/mL dla CBLA). Alternatywnie, CRM zawierające pojedyncze kannabinoidy, jak pokazano w tabeli materiałów, mogą być również użyte do sporządzenia roztworu do identyfikacji piku.

Chromatografia

Parametry systemu i metody (szybkie metody o wysokiej rozdzielczości, szybkie metody gradientowe i niskociśnieniowe metody izokratyczne)

Metoda	Niskociśnieniowa izokratyczna	Szybka metoda wysokiej rozdzielczości	Rapid Gradient
Kolumna	Ascentis® Express C8 (2.7 µm) 150x3,0 mm	Ascentis® Express C18 (2 µm) 150x2.1 mm	Ascentis® Express C18 (2,7 µm) 150x3.0 mm
Faza ruchoma A	5 mM mrówczan amonu + 0.1% kwasu mrówkowego w wodzie
Faza ruchoma B	0.1% kwas mrówkowy w acetonitrylu
Warunki fazy ruchomej	Izokratyczne: 27:73, A:B	75% do 90% B w ciągu 2 min; utrzymywano 90% B przez 5 min	75% do 85% B w ciągu 2 min; utrzymywano 85% B przez 5 min
Prędkość przepływu (ml/min)	0.7	0,4	0,8
Column Temp. (°C)	30	25	25
Detekcja UV (nm)		228
Wtrysk (µL)	5	3	5
Maks. ciśnienie (Bar)	220	540	250
Instrument	System LC Agilent 1290 Infinity II; pompa czwartorzędowa; rurka 0.12 mm ID; 10 mm Max-Light Cartridge Cell 1.0 µL

Niskociśnieniowa metoda izokratyczna: Roztwór wzorcowy i próba ślepa

Chromatogramy: Roztwory standardowe

Szybka metoda gradientowa o wysokiej rozdzielczości: Roztwór wzorcowy i próba ślepa

Metoda szybkiego gradientu: Roztwór wzorcowy i próba ślepa

Przydatność systemu: Rozwiązania do identyfikacji wartości szczytowych

Analit	Niskociśnieniowa metoda izokratyczna		Analit	Szybka Metoda Gradientowa Wysokiej Rozdzielczości		Metoda szybkiego gradientu
Rozdzielczość	% RSD (n=7)	Rozdzielczość		% RSD (n=7)	Rozdzielczość	% RSD (n=7)
CBDVA	-	0.2	CBDVA	-	0.26	-	0.39
CBDV	5.2	0.14	CBDV	4	0.28	4.6	0.38
CBDA	7.4	0.14	CBDA	9.7	0.27	9	0.35
CBGA	2.4	0.15	CBGA	2.6	0.27	1.8	0.36
CBG	4.5	0.21	CBG	2.5	0.29	3	0.38
CBD	1.6	0.14	CBD	2.7	0.37	3.1	0.45
THCV	2.1	0.47	THCV	5.3	0.3	5	0.39
THCVA	5.7	0.27	THCVA	10.8	0.29	9	0.25
CBN	6.4	0.26	CBN	4	0.3	3.4	0.36
CBNA	2.8	0.54	CBNA	8	0.48	6.6	0.59
∆-9-THC	6.8	0.36	∆-9-THC	3	0.27	3.5	0.53
∆-8-THC	1	0.72	∆-8-THC	1.9	0.3	1.6	0.55
THCA	5.5	0.39	CBL	6.2	0.28	5.8	0.53
CBL	1.7	0.3	CBC	2	0.3	1.6	0.44
CBC	1.8	0.17	THCA	2.1	0.26	1.4	0.39
CBCA	1.5	0.35	CBCA	4.4	0.32	4	0.71
CBLA	3	0.45	CBLA	4.1	0.37	3.6	0.69

Niskociśnieniowa metoda izokratyczna: 17 kannabinoidów w roztworze do identyfikacji pików

Szybka metoda o wysokiej rozdzielczości: 17 kannabinoidów w roztworze do identyfikacji pików

Metoda szybkiego gradientu: 17 kannabinoidów w roztworze do identyfikacji pików

Wyniki: Profil kannabinoidowy i siła działania kwiatu konopi

Niskociśnieniowa metoda izokratyczna

Analit	% masy	Overlay Peak Identification Solution
CBDA	18.% masy	Overlay of Peak Identification Solution and Hemp Extract
CBDA	18.20
CBG	0.13
CBD	1.40
CBN	ND
Delta 9	0.22
THCA	0.46
Total THC	0.62
Total CBD	17.36

Szybka metoda gradientowa o wysokiej rozdzielczości

Analit	% masy	Overlay Peak Identification Solution
CBDA	18.% masy	Overlay of Peak Identification Solution and Hemp Extract
CBDA	18.08
CBG	0.10
CBD	1.40
CBN	ND
Delta 9	0.24
THCA	0.50
Total THC	0.68
Total CBD	17.26

4.1 Niskociśnieniowa metoda izokratyczna: Liniowość i zakres (0,25-100 µg/ml)

Obszar szczytowy
µg/mL	&    CBDA	CBG	CBD	CBN	∆9-THC	inbsp;  THCA
0.25	6.5	3.8	3.8	9.2	3.1	7.8
0.5	13.2	7	6.7	16.6	6.1	13.8
1	26.4	13.9	14	33	12.4	25.8
5	137.7	71.5	72.6	170.8	64.7	128.7
25	706.1	367.5	373.1	881.9	332.4	652.5
100	2813	1476.5	1512.1	3523.4	1339.7	2581.7

4.2 Szybka metoda gradientowa o wysokiej rozdzielczości: Liniowość i zakres (0,25-100 µg/ml)

Obszar szczytowy
µg/mL	CBDA	CBG	CBD	nbsp;   CBN	nbsp;  ∆9-THC	THCA
0.25	7.2	4.3	3.7	8.3	3.3	6.7
0.5	14.1	7.9	7.4	17.1	6.3	12.7
1	28.5	15.8	16.9	34.2	13.2	25.6
0.5	143.2	73.9	76.5	176.1	67	132.3
25	739.3	382.1	389.4	895.4	337.5	676
100	2935.2	1534.8	1564.1	3547.2	1350.6	2673.6

5.0 Wnioski: Dokładna analiza kannabinoidów za pomocą HPLC

W celu uproszczenia profilowania kannabinoidów i określania siły działania opracowano kompletny przepływ pracy HPLC. Ten przepływ pracy oferuje proste przygotowanie próbki i wybór trzech metod:

• Instrukcje krok po kroku dotyczące przygotowania próbki i analizy 17 kannabinoidów
• Szybka metoda gradientowa o wysokiej rozdzielczości: 6 minut na kolumnie C18 (2 µm)
• Szybka metoda gradientowa: 6 minut na kolumnie C18 (2,7 µm)
• Low Pressure Isocratic Method: 8 minut na kolumnie C8 (2.7 µm)
• Niskie natężenie przepływu w celu zmniejszenia zużycia rozpuszczalnika
• Kompatybilność ze spektrometrią mas

Używając metody szybkiego gradientu o wysokiej rozdzielczości i niskociśnieniowej metody izokratycznej w podejściu ortogonalnym, stwierdzono, że całkowita zawartość THC znacznie przekroczyła limit 0,3% narzucony przez przepisy.3% całkowitego limitu THC nałożonego przez tymczasowe przepisy końcowe Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. Wyniki uzyskane metodą szybkiego gradientu były porównywalne (dane nie pokazane). Chociaż poziomy ∆9-THC były niskie, obecna była znaczna ilość formy kwasowej (THCA). Badana próbka konopi ilustruje wyzwania związane z produkcją konopi w celu uzyskania wyników w odpowiednim czasie przed zbiorem, zanim zawartość THC przekroczy wymogi prawne. Szybkie i dokładne metody wspierają terminową analizę konopi i marihuany.

Wyniki potwierdziły wysoką całkowitą zawartość CBD, przy czym większość stwierdzono w postaci kwaśnej (CBDA). Wyniki wszystkich metod były zgodne i wykazały wysoki stopień selektywności pomimo obfitości składników matrycy.

Metody te można łatwo zastosować do ilościowego oznaczania kannabinoidów w materiale roślinnym o stężeniach od 0,05 do 100% wagowych. Krótki czas działania i niskie zużycie rozpuszczalnika sprawiają, że metody te są opłacalne dla wysokowydajnych testów potencji.

Literatura

• Ilość kannabinoidów w suszonych materiałach roślinnych, koncentratach i olejach z konopi indyjskich przy użyciu techniki chromatografii cieczowej z opcjonalną detekcją spektrometryczną: Single-Laboratory Validation Study, First Action 2018.11
• AOAC SMPR 2017.002. Standard Method Performance Requirements (SMPRs) for Quantitation of Cannabinoids in Dried Plant Materials
• AOAC SMPR 2019.003. Standard Method Performance Requirements (SMPRs) for Quantitation of Cannabinoids in Plant Materials of Hemp (Low THC Varieties Cannabis sp.)
• AOAC SMPR 2017.019. Standard Method Performance Requirements (SMPRs) for Quantitation of Cannabinoids in Edible Chocolate
• AOAC SMPR 2017.001. Standard Method Performance Requirements (SMPRs) for Quantitation of Cannabinoids in Cannabis Concentrates
• Establishment of a Domestic Hemp Production Program
• Wytyczne dla stanowych programów testowania medycznej marihuany (Stowarzyszenie Laboratoriów Zdrowia Publicznego)