Oznaczanie wody w marihuanie i konopiach metodą miareczkowania Karla Fischera

Anita Piper, R&D Scientist, Bruce Herzig, R&D Scientist, Bettina Straub-Jubb, Global Product Manager Titration

Merck

Article from Analytix Reporter - Issue 12

Wprowadzenie

Konopie i marihuana stają się ważnymi produktami rolnymi i są coraz częściej wykorzystywane w produktach leczniczych, kosmetykach, żywności, olejach i włóknach tekstylnych na całym świecie. Rynek konopi indyjskich szybko rośnie, głównie ze względu na wykorzystanie ich przez przemysł farmaceutyczny jako środków terapeutycznych w leczeniu.

Woda w marihuanie i konopiach wpływa na określenie mocy i musi być dokładnie określona, aby obliczyć prawidłową zawartość delta-9 tetrahydrokannabinolu (THC) w roślinie. Chociaż oba typy roślin mają podobne właściwości, marihuana zawiera większą ilość THC w porównaniu do konopi. Aby jednak konopie mogły być legalnie klasyfikowane jako konopie, Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) ustalił limit całkowitego stężenia delta-9 tetrahydrokannabinolu (THC). Limit ten wynosi nie więcej niż 0,3% THC w przeliczeniu na suchą masę (patrz definicja 7 CFR Part 990 Oct 2019).¹ Wytyczne Unii Europejskiej określają obecnie limit ≤ 0,2% dla całkowitego stężenia THC w przeliczeniu na suchą masę.2% dla całkowitego stężenia THC w przeliczeniu na suchą masę konopi przemysłowych (stan na styczeń 2022 r.).²

Aby obliczyć stężenie delta-9 THC w suchej masie, należy zastosować dokładną metodę analityczną w celu określenia dokładnej zawartości wody. Obecnie większość laboratoriów stosuje metody strat podczas suszenia (LOD), które mierzą wszystkie lotne składniki poprzez ogrzewanie. Może to jednak zawyżać zawartość wody w próbce, co z kolei prowadzi do nieprawidłowego stężenia delta-9 THC w suchej masie, co skutkuje błędną klasyfikacją jako konopi. Może to potencjalnie prowadzić do kar dla rolnika lub przetwórcy lub do przymusowego zniszczenia ich produktu.

Celem tej aplikacji jest zademonstrowanie metody oznaczania wilgotności konopi i kwiatów konopi, która jest selektywna dla wody, a także zapewni szybkie i dokładne wyniki testów.

Metody oznaczania zawartości wody

Oceniono trzy metody oznaczania wody w konopiach i marihuanie:

• Straty podczas suszenia (LOD)
• Metoda piecowa Karla Fischera z kulometrią
• Bezpośrednie wolumetryczne miareczkowanie Karla Fischera z ekstrakcją zewnętrzną

Straty podczas suszenia to prosta technika oparta na ważeniu, która usuwa wodę poprzez ogrzewanie. Potrzebny sprzęt jest niedrogi, ale metoda może być czasochłonna. Obecnie metoda ta jest powszechnie stosowana w kilku różnych branżach. Jednak metoda strat podczas suszenia nie jest specyficzna dla wody, a uzyskane wyniki testu mogą obejmować również ilości innych lotnych związków. W zależności od wybranych warunków może to prowadzić do nieprawidłowej wartości wody, co z kolei wpłynęłoby na dokładność podanego wyniku stężenia THC w suchej masie.

Metody oparte na miareczkowaniu Karla Fischera są proste do przeprowadzenia, ale sprzęt jest nieco droższy niż ten używany do oznaczania LOD. Zaletą metody miareczkowania Karla Fischera jest jej specyficzność dla wody. W rezultacie podawana wartość wody nie obejmuje ilości innych lotnych związków. Oceniono dwie metody oparte na miareczkowaniu Karla Fischera - kulometrię z piecem Karla Fischera i bezpośrednie miareczkowanie wolumetryczne z zewnętrzną ekstrakcją. Metoda kulometryczna najlepiej nadaje się do próbek o niskiej zawartości wody w zakresie od 10 ppm do 10 000 ppm (1%) lub gdy dostępny jest tylko niewielki materiał próbki. Z kolei miareczkowanie wolumetryczne stosuje się do próbek stałych i ciekłych o zawartości wody od 0,01% do 100%. Próbki do bezpośredniego miareczkowania wolumetrycznego Karla Fischera muszą być rozpuszczalne w rozpuszczalniku Karla Fischera. Organiczne materiały roślinne, takie jak konopie i marihuana, nie nadają się do bezpośredniego pomiaru, dlatego stosuje się albo zewnętrzną ekstrakcję odpowiednim rozpuszczalnikiem, albo metodę miareczkowania Karla Fischera w piecu. Metoda piecowa Karla Fischera jest idealna do tego pomiaru, ponieważ całkowicie odparowuje wodę z próbki i bezpośrednio przenosi ją do titratora. Zbadano oba podejścia bezpośredniego miareczkowania wolumetrycznego po ekstrakcji zewnętrznej oraz metodę piecową Karla Fischera. Zawartość wody w drobno zmielonych próbkach kwiatów konopi została określona przy użyciu metod opisanych poniżej. W przypadku każdej analizy konopi lub marihuany ważne jest odpowiednie przygotowanie, aby zapewnić reprezentatywną i dobrze zhomogenizowaną próbkę. Metodą homogenizacji próbki, która jest często stosowana w branży, jest kriogeniczne mielenie kulowe. Powoduje to dokładną homogenizację próbki i prowadzi do uzyskania cząstek o wielkości 100 µm lub mniejszych.

Doświadczalne

Użyte oprzyrządowanie Karla Fischera

• Kulometr Karla Fischera
• Piekarnik Karla Fischera z procesorem próbek
• Wolumetr Karla Fischera z biuretą 5 ml

Warunki eksperymentalne - metoda piecowa Karla Fischera z kulometrią

Tabela 1. Odczynniki stosowane do oznaczania wody metodą piecową Karla Fischera z kulometrią

Odczynniki & Próbka
Standard:	Water standard oven 1%, solid water standard for Karl Fischer oven method Aquastar® (1.88054)
Typ komory:	Komora bez membrany
Typ odczynnika:(Anolit)	CombiCoulomat fritless; odczynnik Karla Fischera do kulometrycznego oznaczania wody dla kuwet z membraną i bez membrany Aquastar® (1.09257) lub Anolit; odczynnik Karla Fischera do kulometrycznego oznaczania wody dla kuwet bez membrany Aquastar® (1.88079)

Tabela 2. Parametry miareczkowania do oznaczania wody metodą piecową Karla Fischera z kulometrią

Ustawienia kulometru dla ogniwa bez membrany, np.
I(pol):	10 µA
Prąd generatora:	400 mV
Punkt końcowy:	50 mV
Drift stop:	Relative < 10 µg/min
Czas mieszania:	5 s
Rozmiar próbki:	20 - 50 mg

Tabela 3. Ustawienia pieca do oznaczania wody metodą piecową Karla Fischera z kulometrią

Ustawienia piekarnika
Temperatura:	150 °C
Czas ekstrakcji:	5 min
Przepływ gazu:	60 - 70 mL/min

Warunki doświadczalne - Bezpośrednie miareczkowanie wolumetryczne Karla Fischera z ekstrakcją zewnętrzną

Tabela 4. Odczynniki stosowane do oznaczania wody metodą miareczkowania objętościowego Karla Fischera z ekstrakcją zewnętrzną

Odczynniki & Próbka
Próbka:	Ekstrakt metanolowy z konopi (z ekstrakcji zewnętrznej), 0,5 - 1.0 g (w zależności od oczekiwanej zawartości wody)
Standard:	Woda wzorcowa 1%, wzorzec do wolumetrycznego miareczkowania Karla Fischera 1 g ≙ 10 mg H2O Aquastar® (1.88052)
Titrant:	CombiTitrant 2 Aquastar® (1.88002)
Rozpuszczalnik:	CombiMethanol Aquastar® (1.88009)

Wyniki i dyskusja

Eksperyment 1 - Oznaczanie wody metodą piecową Karla Fischera z kulometrią

Zawartość wody w próbce konopi oznaczono za pomocą kulometrycznego miareczkowania Karla Fischera w połączeniu z piecem Karla Fischera. Przed analizą przeprowadzono rampę temperaturową w celu oceny optymalnej temperatury, w której woda jest całkowicie i skutecznie uwalniana bez rozkładu próbki. Optymalna temperatura dla użytej próbki została ustalona na 150 °C. Próbki zostały zważone do zapieczętowanych fiolek w celu użycia w piecu Karla Fischera. Pusta fiolka została użyta jako ślepa próba w celu określenia wody, która mogła przylgnąć do fiolki. Wartość uzyskana dla ślepej fiolki została odjęta od wartości każdej próbki określonej przez urządzenie.

Próbka została przeanalizowana w kwintuplikacie, a zmierzone wartości zostały uśrednione w celu uzyskania wyniku (patrz wyniki z 2 różnymi odczynnikami kulometrycznymi, CombiCoulomat i Anolyte, w Tabelach 5 i 6).

Tabela 5. Wyniki miareczkowania Karla Fischera w piecu z bezfrytowym urządzeniem Aquastar^® CombiCoulomat

Próbka	Waga (g)	Dryft początkowy (µg/min)	Czas (min)	Zawartość wody (%)
1	0.0255	6.8	16	7.59
2	0.0222	6.2	14	7.51
3	0.0271	6.1	19	7.69
4	0.0250	5.4	19	7.79
5	0.0303	5.7	21	7.78
Średnia				7.67
Odchylenie standardowe				0.12
%RSD				1.60

Tabela 6. Wyniki miareczkowania piecowego Karla Fischera z użyciem Aquastar^® Anolyte

Próbka	Waga  (g)	Dryft początkowy  (µg/min)	Czas  (min)	Zawartość wody (%)
1	0.0239	5.4	15	7.42
2	0.0265	5.1	19	7.67
3	0.0237	5.2	18	7.67
4	0.0244	4.7	19	7.75
5	0.0333	4.9	24	7.59
Średnia				7.62
Odchylenie standardowe				0.13
%RSD				1,65

Eksperyment 2 - Oznaczanie wody metodą miareczkowania objętościowego z ekstrakcją zewnętrzną

1 g konopi ekstrahowano 25 g metanolu mieszając w fiolkach zamkniętych przegrodą. Zastosowano różne warunki ekstrakcji (czas i temperatura ekstrakcji). Oznaczona wartość wody w metanolu została użyta jako wartość ślepa do wykorzystania w końcowych obliczeniach. Stałe konopie pozostawiono do osadzenia, a dokładną wagową porcję mieszaniny (metanol/ekstrahowana woda) pobrano za pomocą strzykawki i wstrzyknięto do celi miareczkowej wolumetrycznego titratora Karla Fischera. Dokładna masa próbki została określona przez ważenie wsteczne. Następnie titrator zmierzył zawartość wody we wstrzykniętej próbce. Dokładna wartość zawartości wody w próbce konopi została następnie obliczona przy użyciu następującego równania:

W₁= [W₃ x (m₁+m₂) - W₂ x m₂]/m₁

Gdzie:	W1 jest wynikiem w %
	W2 to % wody w metanolu użytym do ekstrakcji
	W3 to % wody określony dla wyekstrahowanej porcji metanolu
	m1 jest masą wyekstrahowanej próbki
	m2 jest masą metanolu ekstrakcyjnego

Wyniki analizy okazały się niewystarczająco powtarzalne i wysoce zależne od wybranych warunków ekstrakcji. W związku z tym nie zostały one tutaj szczegółowo przedstawione. Stwierdzono, że technika ekstrakcji zewnętrznej jest niekorzystna w porównaniu z techniką pieca KF i dlatego nie może być zalecana do oznaczania wody w konopiach.

Eksperyment 3 - Oznaczanie zawartości wody przez stratę podczas suszenia (LOD)

W tym eksperymencie zawartość wody w próbce została określona przez stratę podczas suszenia aż do osiągnięcia stałej masy. Próbkę ogrzewano przez 2 godziny w temperaturze 150˚C. Masę próbki określono przed i po ogrzewaniu, aby obliczyć masę utraconą podczas eksperymentu - stratę podczas suszenia. Próbka została przeanalizowana w dwóch egzemplarzach, a wartości zostały uśrednione w celu uzyskania wyniku (patrz wyniki w Tabeli 7).

Tabela 7. Strata na wynikach suszenia

Próbka	Waga początkowa (g)	Waga po 2 h w 150 °C (g)	Utrata masy (%)
1	1.7093	1.5307	10.45
2	2.0872	1.8748	10.18
Średnia			10.31

Porównanie metody piecowej Karla Fischera i straty podczas suszenia

Metodę piecową Karla Fischera z kulometrią porównano z metodą straty podczas suszenia (patrz Tabela 8). Wyniki dla tej ostatniej (LOD) były o około 35% wyższe niż dla metody piecowej Karla Fischera. Wymaga to rozważenia pomiaru innych lotnych związków metodą strat przy suszeniu, aby uniknąć błędnych wyników zawartości wody.

Tabela 8. Porównanie zawartości wody mierzonej metodą kulometrii Karla Fischera z piecem i stratami podczas suszenia

Próbki	Zawartość wody (%) Piec Karla Fischera + Kulometria  CombiCoulomat fritless	Zawartość wody (%) Piec Karla Fischera + Kulometria Anolit	Zawartość wody (%)  Strata przy suszeniu (LOD)
1	7.59	7.42	10.45
2	7.51	7.67	10.18
3	7.69	7.67
4	7.79	7.75
5	7.78	7.59
Średnia	7.67	7.62	10.31

Wnioski

Zawartość wody w próbkach konopi określono za pomocą technik miareczkowania Karla Fischera (kulometria z piecem; miareczkowanie wolumetryczne z ekstrakcją zewnętrzną) i porównano z utratą podczas suszenia.

Miareczkowanie kulometryczne Karla Fischera w połączeniu z piecem Karla Fischera zapewnia powtarzalne wyniki. Zapobiega przeszacowaniu zawartości wody spowodowanemu przez związki lotne, co należy wziąć pod uwagę w przypadku metody strat podczas suszenia. Ponadto wymaga jedynie niewielkiej ilości próbki i odczynnika. Wolumetryczne miareczkowanie Karla Fischera z ekstrakcją zewnętrzną nie dało powtarzalnych wyników i dlatego nie jest zalecane. Można jednak zastosować wolumetryczną metodę Karla Fischera w połączeniu z piecem Karla Fischera, ale ponieważ wolumetria nie jest tak czuła jak kulometria, wielkość próbki musi zostać zwiększona, aby uzyskać wiarygodne wyniki.

Dlatego zaleca się stosowanie metody pieca Karla Fischera z kulometrią do oznaczania wody w konopiach i konopiach indyjskich w celu uzyskania najdokładniejszych wyników. Umożliwia to dokładne i precyzyjne obliczenie stężenia delta-9 THC w suchej masie.

Zobacz także naszą stronę z testami marihuany pod adresem SigmaAldrich.com/cannabis

.

Referencje

1. Establishment of a Domestic Hemp Production Program . [Internet]. Department of Agriculture: Agricultural Marketing Service, 7 CFR Part 990 (Oct 2019) 84 FR 58522 .[cited 13 Jan 2022]. Available from: https://www.federalregister.gov/d/2019-23749

2. European Commission - Hemp. [Internet].[cited 13 Jan 2022]. Available from: https://ec.europa.eu/info/food-farming-fisheries/plants-and-plant-products/plant-products/hemp_en#definitionandprovisions