天然のトリプシンインヒビターはセリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）としても知られ、プロテアーゼ阻害剤の中で最も種類が多い最大のファミリーです。1セルピンはin vivoでセリンプロテアーゼを阻害することでタンパク質の活性および異化をコントロールします。2
トリプシンインヒビターは、ウシ膵臓、オボムコイド、大豆、ライマメの4種類の天然由来のものがあります。各阻害剤は基質の競合的アナログとして作用し、セリンプロテアーゼに結合して不活性複合体を形成し、プロテアーゼを不活化します。3
このプロセスにより、セルピン（トリプシンインヒビター）は、セリンプロテアーゼの機能が不要になったときにセリンプロテアーゼによるタンパク質分解作用を止めることができます。
トリプシンインヒビターはその由来に応じてそれぞれの機構で作用します。例えば、豆類（大豆・ライマメ）の種子に存在するインヒビターは中腸のプロテアーゼを阻害し、昆虫の摂食抑制剤として作用します。この天然機能は、昆虫抵抗性形質転換植物の開発で利用が増えています。大豆由来インヒビターはラットの膵臓肥大に寄与することもわかっており、やはり摂食抑制剤になります。Bowman-Birk型大豆インヒビターはがん予防剤として研究が進められています。4
製品
図1．T0256-ウシ膵臓由来トリプシンインヒビター
別名：BPTI（ベーシック膵臓トリプシンインヒビター）
分子量：～6.5 kDa（単鎖58アミノ酸ペプチド）
pI：～10.5
比活性：トリプシンインヒビター1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE 単位の活性を有するトリプシン1.5 mg超を阻害します
ニュージーランド産ウシ膵臓に由来
溶解性：本製品は2 mg/mLで水に溶けます
BPTIはアミノ酸58個から成るポリペプチド単鎖で、3つのジスルフィド結合を有します。5
BPTIはウシおよびヒトのトリプシン、キモトリプシン、カリクレイン、およびプラスミンを阻害します。BPTIはブタエラスターゼを阻害しません。6
図2．T9253-ニワトリ卵白由来トリプシンインヒビター（II-O型）
別名：オボムコイド
分子量：～28 kDa
pI：4.17
比活性：1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン0.8～1.2 mgを阻害します。また、タンパク質1 mg当たり約40 BTEE単位の活性を持つキモトリプシン0.3 mg以下を阻害する場合があります。
溶解性：本製品は0.67 Mリン酸緩衝液（pH 7.6、2 mg/mL）に溶けます。
ニワトリオボムコイドはウシトリプシンを阻害する主要糖タンパク質の1つです。ニワトリオボムコイドは、3つのタンデムドメインに配列された186のアミノ酸で構成されています。8各ドメインは3つのジスルフィド結合、2つのトリプシン残基、および1つの活性部位を含んでいます。9オボムコイドはトリプシンの単頭インヒビターと説明されており、各オボムコイド分子はトリプシンと1：1で結合することを意味しています。7
本製品はオボインヒビターを若干含んでいます。オボインヒビターは、オボムコイドとは別のニワトリ卵白由来プロテアーゼ阻害剤です。オボインヒビターには5つ以上の結合部位があり、ウシトリプシン、ウシキモトリプシン、およびブタエラスターゼを阻害します。10トリプシンおよびキモトリプシンの結合部位はそれぞれ2か所あり、残り1つの部位にはエラスターゼが結合します。11オボムコイドおよびオボインヒビターは、ニワトリ卵白中に豊富に存在するプロテアーゼ阻害物質で、ニワトリ卵白、タンパク質にそれぞれ11％および1.5%含まれています。12
Type III-O（オボインヒビターフリー）
別名：オボムコイド
分子量：～27 kDa
比活性：本製品1 mgで、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン1.0～2.0 mgを阻害します。
溶解性：本製品は0.67 Mリン酸緩衝液（pH 7.6、2 mg/mL）に溶けます。
本製品は上述の製品T9253と同じ特徴を持っていますが、硫酸アンモニウムおよびろ過プロセスによりさらに精製し、オボインヒビターを除去しています。オボインヒビターを含まないため、オボムコイドの純度が高くなり、トリプシンと1：1の比で複合体を形成し、持続的に阻害します。
Type II-T
別名：七面鳥オボムコイド
分子量：～20 kDa
比活性：1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン0.9～1.3 mgを阻害します。また本品1 mgは、タンパク質1 mg当たり約40 BTEE 単位の活性を有するα-キモトリプシン0.4～1.0 mgを阻害します。
溶解性：本製品は0.67 Mリン酸緩衝液（pH 7.6、1 mg/mL）に溶けます。
七面鳥卵白由来トリプシンインヒビターには独立した2つの結合部位があり、1つはウシトリプシン、もう1つはα-キモトリプシンに結合します。低pH値（2.0）では3つ目のドメイン（OMTKYT3）が出現し、中性錯体に親和性がある大半のセリンプロテアーゼを阻害します。13
KunitzおよびBowman-Birk（BBI）大豆プロテアーゼインヒビター
この2つのタンパク質は、大豆に最も豊富に存在するプロテアーゼインヒビターです。分子量8 kDaのBBIはトリプシンとキモトリプシンの両方を強く阻害し、それぞれに対して別々の結合部位を有しています。分子量20.1 kDaのKunitzインヒビターの結合部位は1つであり、トリプシンを強く阻害する一方、キモトリプシンへの結合は弱いです。
図3．Glycine max（大豆）由来トリプシンインヒビター：Kunitzインヒビター
別名：Kunitzトリプシンインヒビター、Tia1、STI、およびSBTI
分子量：20.1 kDa
pI：4.525
吸光係数：E1% = 9.94
（280 nm、pH 7.6緩衝液）
大豆トリプシンインヒビターはKunitzによって初めて単離されました。14 他にも数種の関連インヒビターが大豆から発見されています。15大豆由来トリプシンインヒビターは単量体タンパク質であり、181個のアミノ酸残基から成るポリペプチド単鎖に2つのジスルフィド架橋があります。16-18
大豆トリプシンインヒビターはトリプシンを阻害し、キモトリプシン19およびプラスミンの阻害はトリプシンに対する阻害よりも弱いです。20大豆トリプシンインヒビターは、トリプシンに対する阻害と同じ機構により、トリプシン以外のプロテアーゼも阻害します。SBTIは血漿カリクレインおよび凝固因子Xaに対する阻害作用も有しています。しかし、大豆トリプシンインヒビターはメタロプロテアーゼ、組織中カリクレイン、酸性プロテアーゼ、およびチオプロテアーゼを阻害しません。
大豆トリプシンインヒビターはプロテアーゼ活性部位と化学量論比1：1で複合体を形成します。この複合体の形成と同時に、トリプシンが本インヒビター上のアルギニン-イソロイシン結合1箇所を切断する場合があります。21,22この阻害は可逆的であると同時にpH依存性です。この複合体の解離により、元のインヒビターまたは修飾されたインヒビターが生じます。23トリプシン結合の至適pHは8.0で、pH 8.0での結合定数は109超、pH 3.6～4.4の結合定数は0.15～2.6 × 104です。24
T9003 - Glycine max （大豆）由来トリプシンインヒビター
Type I-S
本品はDEAEセファロースを用いたクロマトグラフィーで精製しており、10%リン酸ナトリウム緩衝塩（pH 7.6）を含みます。
比活性：1 mgは、タンパク質1 mgあたり約10,000 BAEE単位の活性を有する1.0～3.0mgのトリプシンを阻害します。
キモトリプシン1 単位はpH 7.8、25℃で1分間に1.0 µmolのBTEEを加水分解します。
溶解性：トリプシンインヒビターは水およびリン酸バッファーに溶けます（10 mg/mL）。平衡塩類溶液（1 mg/mL）および血清フリー培地にも溶けます。濃度10 mg/mLを超える溶液は濁った黄色～琥珀色を呈する場合があります。
保管／安定性：分注凍結後、本製品は−20℃で活性を保ちますが、凍結解凍は避けてください。このタンパク質を80℃まで短時間加熱すると可逆的な変性を起こし、90℃にまで短時間加熱すると不可逆的な変性を起こします。15
T6522 - Glycine max （大豆）由来トリプシンインヒビター
Type I-S
細胞培養テスト済み
本品はDEAEセファロースを用いたクロマトグラフィーで精製しており、10%リン酸ナトリウム緩衝塩（pH 7.6）を含みます。
比活性：1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE 単位の活性を有するトリプシン1～3 mgを阻害します。
溶解性：トリプシンインヒビターは水およびリン酸緩衝液に溶けます（10 mg/mL）。平衡塩類溶液（1 mg/mL）および血清フリー培地にも溶けます。濃度10 mg/mLを超える溶液は濁った黄色～琥珀色を呈する場合があります。
保管／安定性：分注凍結後、本製品は−20℃で活性を保ちますが、凍結解凍は避けてください。このタンパク質を80℃まで短時間加熱すると可逆的な変性を起こし、90℃にまで短時間加熱すると不可逆的な変性を起こします。15
T6414 - Glycine max （大豆）由来トリプシンインヒビター
本製品は滅菌ろ過しており、1倍溶液（0.1%トリプシンインヒビター-ダルベッコPBS溶液）に溶解され、細胞培養の用途に適しています。内皮細胞の継代に対し最適化されています。
保管／安定性：分注凍結後、本製品は−20℃で活性を保ちますが、凍結解凍は避けてください。このタンパク質を80℃まで短時間加熱すると可逆的な変性を起こし、90℃にまで短時間加熱すると不可逆的な変性を起こします。15
T9008 - Glycine max （大豆）由来トリプシンインヒビター、1%水溶液
細胞培養での用途で使用します
滅菌ろ過されたT9003から調製および処理され、簡便なバッファー非含有の溶液が得られます。
保管／安定性：本製品は2～8℃で保存します。本製品は分注凍結し−20℃で保存できますが、凍結解凍の繰り返しは避けてください。このタンパク質を80℃まで短時間加熱すると可逆的な変性を起こし、90℃にまで短時間加熱すると不可逆的な変性を起こします。15
T9128 - Glycine max （大豆）由来 トリプシンインヒビター
Type II-S
硫酸アンモニウム分画で調製し、一連の精製ステップを経て、組成90%タンパク質-10%リン酸ナトリウム緩衝塩（pH 7.6）にした製品
比活性：1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン1.0 mg以上を阻害します。
溶解性：本製品は水に溶けます（1 mg/mL）。濃度10 mg/mLを超える溶液は濁った黄色～琥珀色を呈する場合があります。
保管／安定性：分注凍結後、本製品は−20℃で活性を保ちますが、凍結解凍は避けてください。このタンパク質を80℃まで短時間加熱すると可逆的な変性を起こし、90℃にまで短時間加熱すると不可逆的な変性を起こします。15
T2327 - Glycine max （大豆）由来トリプシンインヒビター
≥98%Kunitz 型インヒビター
T9128をクロマトグラフィーによりさらに精製した、高純度Kunitz 型トリプシンインヒビター。
本製品は、10%リン酸ナトリウム緩衝塩（pH 7.6）を含みます。
比活性：1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン1.6 mg以上阻害します。
溶解性：本製品は水およびリン酸緩衝液に溶けます（10 mg/mL）。濃度10 mg/mLを超える溶液は濁った黄色～琥珀色を呈する場合があります。
保管／安定性：分注凍結後、本製品は−20℃で活性を保ちますが、凍結解凍は避けてください。このタンパク質を80 ℃まで短時間加熱すると可逆的な変性を起こし、90℃にまで短時間加熱すると不可逆的な変性を起こします。15
図4．T9777-Glycine max（大豆）由来トリプシン-キモトリプシンインヒビター
別名：Bowman–Birkインヒビター（BBI）
CAS 番号：37330-34-0
ユニット定義：トリプシン1単位（反応液量3.2 mL）を、pH 7.6、25℃で基質BAEEと反応させると1分当たりのΔA253が0.001になります（反応液量3.2 mL、光路1 cm）。
分子量：8 kDa29
大豆由来Bowman-Birkインヒビター（BBI）は単量体タンパク質であり、71個のアミノ酸残基から成るポリペプチド単鎖に7つのジスルフィド架橋があります。26このインヒビターには独立した2つの結合部位があり、1つはトリプシン、もう1つはキモトリプシンに結合し、阻害します。27BBIはそれぞれのプロテアーゼと1：1で結合し、複合体を形成します。BBIの障害は非競合的なので、2つの酵素と三元複合体を形成することができます。28
本製品はDEAEセファロースを用いたクロマトグラフィーで精製しており、20%リン酸ナトリウム緩衝塩（pH 7.6）を含みます。
比活性：1 mgはタンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン0.5 mg以上を阻害します。
また1 mgは、タンパク質1 mg当たり約40 BTEE単位の活性を有するキモトリプシン1.0 mg以上を阻害します。
溶解性：トリプシン-キモトリプシンインヒビターは、水および0.67 Mリン酸緩衝液（pH 7.6、1 mg/mL）に溶けます。
Phaseolus limensis（リママメ）由来トリプシンインヒビター：
別名：リママメ由来トリプシンインヒビター（LBTI）
分子量：9 kDa
pI：4.525
吸光係数：E1% = 9.94
（280 nm、pH 7.6緩衝液）
リママメ由来トリプシンインヒビターは83個のアミノ酸から成る単量体で、濃度依存的に二量体化します。自己会合の程度は異型のタイプおよびpHに依存します。30
Phaseolus limensis由来トリプシンインヒビターには4～6個の異型があり、そのトリプシン阻害活性は基本的に同等ですが、キモトリプシンの阻害についてはいくつかの違いがあります。異型のアミノ酸配列は類似しており、いずれも7つのジスルフィド結合を有しています。31
トリプシンインヒビターはプロテアーゼ活性部位と化学量論比1：1で複合体を形成します。複合体になったトリプシンインヒビターは、結合相手と同一酵素をさらに阻害することはなくなりますが、結合相手ではないトリプシンまたはキモトリプシンに対しては100％の阻害活性があります（1：1：1の複合体になる）。30,32これはトリプシン用とキモトリプシン用の結合部位が1つずつあることを意味します。トリプシンはLys-Ser部位に結合するのに対し、キモトリプシンはLeu-Ser部位に結合します。31この阻害は可逆的であると同時にpH依存性です。この複合体の解離により、元のインヒビターまたは修飾されたインヒビターが生じます。23トリプシン結合の至適pHは8.0で、pH 8.0での結合定数は109超、pH 3.6～4.4の結合定数は0.15～2.6 × 104 です。24
T9378 - Phaseolus limensis（リママメ)由来トリプシンインヒビター
本製品は、10%リン酸ナトリウム緩衝塩（pH 7.6）を含む凍結乾燥粉末です。
比活性：1 mgは、タンパク質1 mg当たり約10,000 BAEE単位の活性を有するトリプシン0.8 mg以上を阻害します。
溶解性：トリプシンインヒビターは水およびリン酸緩衝液に溶けます（1 mg/mL）。平衡塩類溶液および血清フリー培地に溶けます。濃度10 mg/mLを超える溶液は濁った黄色～琥珀色を呈する場合があります。
トリプシンインヒビター活性のアッセイ法
ほとんどのトリプシンインヒビター調製液の活性は連続速度分光光度アッセイで求め、阻害されたBAEEの単位数で表します。
単位の定義：トリプシン1単位を、pH 7.6、25℃で基質BAEEと反応させると1分当たりのΔA253が0.001になります。反応液量＝3.2 mL。
条件
温度 25℃、pH = 7.6、A 253 nm、光路 1 cm
反応液3.2 mL中の最終濃度：63 mMリン酸ナトリウム、0.23 mM Nα-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル（BAEE）、0.002 mM塩酸、0.005 mgトリプシン、0.003～0.001 mgトリプシンインヒビター。
必要な試薬
S0751 - リン酸モノナトリウム
B4500 - Nα-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル塩酸塩（BAEE）
258148 - 塩酸ACS 試薬
T8003 - ウシ膵臓由来トリプシン
試薬
- 67 mMリン酸ナトリウム緩衝液（25℃、pH 7.6）
［無水リン酸モノナトリウム（製品番号：S0751）を脱イオン水に溶かして100 mLにする。1 M NaOHで25℃でpH 7.6に調節する。］ - 0.25 mM Nα-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル溶液（BAEE）
［Nα-ベンゾイル-L-アルギニンエチルエステル塩酸塩（製品番号：B4500）を試薬aに溶かし、50 mLにする。］ - 1 mM塩酸溶液（HCl）
［濃 塩酸（製品番号：258148）を脱イオン水で50 mLにする。］ - トリプシン酵素溶液（トリプシン）
［用時調製。冷却した試薬Cを用いてトリプシン（製品番号：T8003）1 mL当たりタンパク質1 mgを含む溶液を調製する。］ - トリプシンインヒビター溶液（インヒビター）
（用時調製。冷却した試薬Aを用いて1.0 mg/mLトリプシンインヒビター溶液を調製する。）
手順
ピペットで以下の試薬（mL）を適切なキュベットに移します。
パートA：
25℃で5～6分間放置する。
以下の試薬を転倒混和し、ピペットで適切なキュベットに移します（mL）：
パートB：
転倒混和し25 ℃になるまで平衡化します。適切な恒温分光光度計を用いて示度が安定するまでA253nmを測定します。次に下記を加えます：
直ちに転倒混和し、A253 nmの増加分を約5分間記録する。試験試料、ブランク、およびインヒビター無添加溶液について、最大線形速度を用いてΔA253 nm／分を算出します。
計算式
| トリプシン活性：BAEE単位／酵素mL＝ | （試料ΔA253 nm／分 – ブランクΔA253 nm／分）（df）（10.0） (0.001)(0.10)(0.5) |
df = 希釈率
0.001＝トリプシン1単位あたりのA253 nm/分（pH 7.6、25℃、反応液3.2 mL）
0.10＝酵素使用量（mL）（パートB）
10.0＝アッセイ総量（mL）（パートA）
0.5＝酵素使用量（mL）（パートA）
Units/mg solid（固体）= |
mg solid/mL酵素 |
トリプシン活性（BAEE単位／タンパク質mg）対トリプシンインヒビターmL/RM
トリプシンインヒビターmg＝（トリプシンインヒビターmL）（トリプシンインヒビター濃度mg/mL）
トリプシンインヒビター1 mgで阻害されるトリプシンmg＝ | トリプシンmg/RM（正規化係数） トリプシンインヒビターmg（プロットから） |
正規化係数＝（非阻害トリプシンBAEE単位／mg solid（固体） ／ 標準トリプシン10,000 BAEE単位）
注記：
- 本酵素アッセイは以下の製品番号に使用されます：T9003、T9008、T9128、T9253、T2011、T4385、T9378、T0256
- トリプシンインヒビターType II-S（製品番号：T9128）のアッセイをするときは、冷却した試薬aで0.60 mg/mLトリプシンインヒビター溶液を調製してください。
- 阻害しないときのトリプシン活性は、表示値の85%以内であること。
- 表示値11,700～13,005トリプシン units/mg solid（固体）の場合、非阻害トリプシン反応活性の許容範囲は10,000～15,300トリプシンunits/mg solid（固体）です。この範囲はΔAbs253nm／分の補正値0.0545～0.0835に相当します。この速度で20%～80%の阻害の場合、ΔAbs253 nm／分は分光光度計の速度検出限界0.0020を超えるはずです。
トリプシンunit換算
1 BAEE µM Unit = 200 BAEE Units
1 TAME µM Unit = 0.27 BAEE µM Units
1 BAEE µM Unit = 3.64 TAME Units
1 TAME µM Unit = 55 BAEE A253 Units
1 BAEE A253 Unit = 0.018 TAME µM Units
1 TAME µM Unit = 180 TAME A247 Units
1 TAME A247 Unit = 0.33 BAEE Units
1 USP Unit = 3.0 BAEE Units
1 NF Unit = 1.1 USP Units
参考文献
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