Technológiai áttekintés
vizsgálati megfontolások
A mennyiségi meghatározás módszerei
Készülékek és kellékek
PCR-keverék kiválasztási útmutató<><>br> Protokoll
Hibaelhárítás
Anyagok/a>
Referenciák
Technológiai áttekintés: A fluoreszcens detektálást tartalmazó termikus ciklálók fejlődésével a PCR új, innovatív alkalmazással rendelkezik. A rutin PCR során a kritikus eredmény a folyamat után keletkező amplikon végső mennyisége. A valós idejű vagy kvantitatív PCR és az RT-PCR a DNS-amplifikáció linearitását használja fel egy ismert szekvencia abszolút vagy relatív mennyiségének meghatározására a mintában. Ha a reakcióban fluoreszcens riportert használunk, akkor lehetőség van a DNS-termelés mérésére.
1. ábra.Technológiai áttekintés: SYBR Green qPCR
A mennyiségi PCR-ben a DNS-amplifikációt a PCR minden egyes ciklusában nyomon követik. Amikor a DNS az amplifikáció log lineáris fázisában van, a fluoreszcencia mennyisége a háttér fölé emelkedik. Azt a pontot, amikor a fluoreszcencia mérhetővé válik, kvantitatív ciklusnak (Cq) vagy határpontnak nevezzük. Ismert mennyiségű standard DNS többszörös hígításával standard görbe készíthető a log koncentráció és a Cq függvényében. A Cq értékből ezután kiszámítható az ismeretlen mintában lévő DNS vagy cDNS mennyisége.
A) A reakció különböző fázisai:
Bázisvonal: A templát kezdeti koncentrációja alacsony; ezért a fluoreszcencia intenzitása túl alacsony ahhoz, hogy kimutatható legyen, és csak a háttérjel látható.
Exponenciális: Miután a target-hozam elérte a kimutatási küszöbértéket, amelyet a piros küszöbvonal mutat, a reakció lefolyása az exponenciális fázison keresztül követhető.
Lineáris: Ahogy a templát koncentrációja növekszik, a rendelkezésre álló DNS-polimeráz koncentrációja csökken, és a reakció sebessége csökken.
Plató: Nincs elegendő szabad enzim az amplifikáció folytatásához, így e pont után a reakció a maximális hozamot, vagyis a platófázist éri el.
B) Az egyes reakciókat azzal a ciklussal jellemezzük, amikor a fluoreszcencia először emelkedik a küszöbérték fölé, amit kvantitatív ciklusnak (Cq) nevezünk. Ha a kiindulási anyag bőséges, az amplifikáció korábbi ciklusokban figyelhető meg, és a Cq alacsonyabb. Ha a kiindulási anyag kevés, az amplifikáció a későbbi ciklusokban figyelhető meg, és a Cq magasabb. Ez a fluoreszcencia, a Cq és az amplifikált termék mennyisége közötti korreláció lehetővé teszi a templát mennyiségi meghatározását széles dinamikai tartományban.
A valós idejű PCR relatív vizsgálatokra is alkalmas. A reakciót az egyes amplifikálandó régiókra egyedi primerekkel és különböző fluoreszcens festékekkel jelölt primerekkel lehet elvégezni. Számos kereskedelmi forgalomban kapható kvantitatív termikus cikláló több detektáló csatornát tartalmaz. Ebben a multiplex rendszerben a cél-DNS/cDNS mennyisége összehasonlítható egy házvezető szekvencia, pl. GAPDH vagy β-aktin mennyiségével.
NR= nem ajánlott
X= ajánlott
XX= preferált módszer
Megfontolandó szempontok a vizsgálathoz
DNS-előkészítés
A PCR sikerének biztosításához a legfontosabb lépés a jó minőségű DNS-előkészítés. A DNS-templát sértetlensége és tisztasága alapvető fontosságú. A kvantitatív PCR több enzimatikus reakciót tartalmaz, ezért érzékenyebb az olyan szennyeződésekre, mint a fehérjék, fenol/kloroform, sók, EDTA és más kémiai oldószerek. A szennyeződések a fluoreszcenciás detektálást is zavarhatják. A 260 nM és 280 nM abszorbanciaértékek aránya a DNS tisztaságának becslését adja. A tiszta DNS esetében az A260/A280 arány 1,8-2,0 közötti. Az alacsonyabb arányok szennyező anyagok, például fehérjék jelenlétére utalnak.
Szablon
A qPCR elindításához nagyon kevés célnukleinsav-kópiára van szükség (ami körülbelül 100 pg gDNS-nek vagy cDNS-nek felel meg). A reakciógátlókkal való szennyeződés minimalizálása érdekében a kiindulási templát mennyiségét a pontos mennyiségi meghatározás eléréséhez szükséges minimumon kell tartani. Ha a kiindulási anyag RNS, a primertervezés és a DNáz I kezelés csökkenti a gDNS-szennyeződésből származó jeleket.
Primertervezés
Függetlenül attól, hogy dsDNS-kötő festéket vagy szonda alapú detektáló kémiát használunk, a qPCR egyik legfontosabb kísérleti előtti lépése a jó minőségű primerek tervezése. A PCR-hez szükséges specifikus primereket primertervezési szoftver segítségével kell megtervezni, hogy kiküszöböljük a primer-dimerekkel és másodlagos struktúrákkal bevezetett bonyodalmakat. Az alacsonyabb primerkoncentrációk csökkentik a primer-dimerek és a nem specifikus termékképződés felhalmozódását, ami kritikus fontosságú a SYBR Green I festék mennyiségi PCR-ben történő használatakor.
dNTP-k
A standard PCR/qPCR mastermixek dATP-t, dCTP-t, dGTP-t és dTTP-t tartalmaznak. Vannak azonban olyan keverékek, amelyek a dTTP-t dUTP-vel helyettesítik. A dUTP-vel futtatott korábbi reakciók termékei uracilt tartalmaznak timin helyett. Ezek azután fogékonyak az Uracil-DNS-glikoziláz (UNG) általi hasításra. Ezért a későbbi reakciók előzetes UNG-vel történő inkubálása megakadályozza a reakciók közötti átviteles szennyeződést. A hatékonyság érdekében a laboratóriumban minden reakcióban dUTP-t kell használni.
Magnéziumkoncentráció
A magnézium-klorid (MgCl2) szükséges a reverz transzkriptáz, a Taq DNS-polimeráz és a Taq DNS 5' - 3' exonukleáz aktivitásához. A DLP-t tartalmazó reakciók optimális Mg2+ koncentrációja általában 3-6 mM között van. Az alacsonyabb magnézium-klorid-koncentrációk általában kevesebb nemspecifikus termék képződését eredményezik. Néhány ReadyMix oldatot 7 mM magnézium-klorid 2X koncentrációban (3,5 mM végkoncentráció) adnak. Egyes esetekben 25 mM magnézium-klorid oldatot tartalmazó fiolát is mellékelnek a végső magnézium-klorid-koncentráció további optimalizálásához, ha szükséges. Néha szükség lehet olyan reakciómixre, amely nem tartalmaz MgCl2 -t, hogy alacsony koncentráció használható legyen, pl. Scorpion Probe detektálás esetén.
Reverse transzkriptáz
Az RT-qPCR sikeréhez kritikus fontosságú egy olyan reverz transzkriptáz enzim, amely magas cDNS-hozamot biztosít, miközben magas hőmérsékleten is megőrzi aktivitását. A magas hőmérsékleten nyújtott teljesítmény segít biztosítani, hogy az RNS jelentős másodlagos szerkezettel rendelkező régiói destabilizálódjanak és hozzáférhetővé váljanak a hibridizáció és az azt követő amplifikáció számára. Az egylépéses RT-qPCR elvégzésekor a magas hőmérsékleten történő teljesítmény lehetővé teszi a magas olvadási hőmérsékletű (Tm) génspecifikus primerek használatát, ami növeli a reakcióspecifikusságot. Kétlépéses protokollok végrehajtásakor fontos annak biztosítása, hogy az enzim lineáris és arányos cDNS-hozamot eredményezzen az RNS-ből. A pipettázás minimalizálásával csökkenthető a változékonyság. Egyes ReadyMixek tartalmaznak primereket és egyéb, az RT elvégzéséhez szükséges reagenseket, például a ReadyScript® cDNA Synthesis Mix (RDRT).
Taq DNS-polimeráz
Az RT-hez legmegfelelőbb reverz transzkriptáz kiválasztásához hasonlóan a megfelelő enzim kiválasztása is létfontosságú. A természetes Taq DNS-polimerázzal alapvető probléma, hogy az enzimnek alacsony hőmérsékleten maradék aktivitása van. A nem specifikus primer-kötés nem specifikus termékképződéshez vezet e maradék polimeráz-aktivitás következtében. Az antitest-blokkolt vagy kémiailag blokkolt Taq DNS-polimerázok ("hot-start") segítenek orvosolni ezt a helyzetet azáltal, hogy megakadályozzák az enzim aktivitását a magas hőmérsékletű denaturációs lépés kezdetéig. A PCR Mix Selection Guide -ban találja meg az Ön alkalmazásához legmegfelelőbb hot-start polimeráz meghatározását.
Belső referenciafesték műszertípusonként
Néhány valós idejű PCR termikus ciklálóhoz betöltő festékre, például ROX-ra van szükség az optikai rendszerben lévő változékonyság ellenőrzéséhez és a jelintenzitásbeli különbségek normalizálásához. Hasonlóképpen, egyes termikus ciklálókhoz fluoreszceinre van szükség a virtuális háttér létrehozásához, amikor SYBR Green I festékkel végzett vizsgálatokkal dolgoznak (amelyeknek nagyon alacsony a háttere). Ezek a ReadyMixben vagy különálló komponensként is szállíthatók, így a megfelelő koncentráció használható. Egyes esetekben a reakció normalizálásához egy fiola belső referenciafestéket is tartalmaznak. E festék maximális gerjesztése 586 nM, maximális emissziója 605 nM. A ROX referenciafesték standard műszerbeállításai kielégítőek a belső referenciafesték méréséhez. Ez a belső referenciafesték az ABI szekvencia detektáló rendszerekhez szükséges.
Műszerek
A műszerekkel kompatibilis reagenseket kell kiválasztani. A platformok különböző normalizációs festékeket használnak, ezért a kompatibilis normalizációs festékekkel rendelkező reagenseket kell kiválasztani (lásd Appendix 1).
Néhány qPCR-műszert úgy terveztek, hogy az alkalmazások egy meghatározott körét támogassa, például állítsa szembe az ABI 7900 nagy áteresztőképességű, 384 lyukú lemezek automatikus betöltését alkalmazó eszközét az Illumina Eco műszerrel, amely egyetlen 48 lyukú lemezt támogat. A legmegfelelőbb műszer megfelel a kutatás igényeinek. Kívánatos olyan műszert választani, amely felhasználóbarát szoftverrel rendelkezik, amely elvégzi a legkívánatosabb funkciókat, és rugalmas az adatkimenet tekintetében, hogy az adatok könnyen kezelhetők legyenek a későbbi statisztikai elemző szoftvercsomagokban. Ez csökkenti a személyzet betanításához és így az eredmények előállításának megkezdéséhez szükséges időt. A további szükséges jellemzők közé tartozik egy olyan PCR-blokk, amely teljesen egységes (abszolút maximális eltérés 1Cq = 2 szeres a 96 replikációs lyukban) és egy olyan optikai rendszer, amely a lehető legérzékenyebben és a lehető legegyenletesebben gerjeszti és detektálja az emissziót a hullámhosszok széles tartományában. Ez lehetővé teszi a fluoroforok széles választékát és a multiplexelést. További megfontolandó jellemzők a speciális fogyóeszközökkel kapcsolatos működési költségek, pl. ha nem szabványos mikrotiterlemezt használunk a reakciókhoz, valamint a nem szabványos formátumú lemezek/csövek betöltésének kényelme.
Kontroll
A pozitív kontroll mindig hasznos, hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a készlet minden összetevője megfelelően működik. Egy sablon nélküli/negatív kontroll szükséges annak megállapításához, hogy van-e szennyeződés. A templát nélküli kontrollban a jel DNS-szennyeződés vagy primer dimer képződés jelenlétét mutatja.
Puffer
A pufferek vagy reakciómastermixek általában dNTP-ket, Taq DNS-polimerázt, MgCl2 és stabilizátorokat tartalmaznak. A SYBR Green I, ROX™, fluoreszcein és inert töltőfestékek is tartalmazhatnak, a detektálási kémiától, a műszertől és a reakció követelményeitől függően. A PCR-pufferkomponensek és stabilizátorok jellemzően a gyártó sajátjai. Külön megvásárolva maximális rugalmasság érhető el, mivel minden egyes összetevő egyedileg optimalizálható a reakcióban. Ezzel szemben azonban, bár az összetevők mastermixként történő együttes megvásárlása csökkenti a rugalmasságot, növeli a tételek konzisztenciáját és kényelmét, miközben csökkenti a pipettázási lépések számát, és ezáltal a hiba és a szennyeződés esélyét.
Adatok elemzése
Követi a kvantitatív SYBR Green PCR elvégzéséhez használt valós idejű műszer ajánlásait. A következők segíthetnek az új műszerhasználóknak. Általában a ciklusok számát a fluoreszcenciával szemben ábrázolják. A küszöbciklusok (CTs) vagy a keresztezési pontok az egyes mintákban lévő templát mennyiségének meghatározására szolgálnak. A küszöbciklus vagy határpont az első olyan ciklus, amely a PCR-termékek képződése miatt kimutatható fluoreszcencia-növekedést mutat. A határpontot megelőző ciklusok az alapciklusok. Az alapciklusok nem mutatnak kimutatható fluoreszcencia-növekedést a PCR-termékek miatt. A fluoreszcencia első kimutatható növekedésének meghatározására használt küszöbérték manuálisan is beállítható. A küszöbértéket mindig logaritmikus amplifikációs grafikonon kell elvégezni. Logaritmikus amplifikációs diagramon a küszöbértéket a log-lineáris tartományban kell beállítani, nem pedig a platófázisban.
Az olvadási görbék
A futás végén végzett olvadási görbeelemzés segít abban, hogy csak az érdeklődésre számot tartó PCR-terméket elemezzük. Kövesse a valós idejű műszer gyártójának utasításait az olvadási görbe elemzéséhez. Az azonos primerekkel végzett egymást követő futtatások módosíthatók úgy, hogy a primer dimer képződésének hozzájárulását a termékjelhez eltávolítsák egy további ciklikus lépés során történő adatgyűjtéssel, amelynek hőmérséklete a már meghatározott dimer és termék olvadási hőmérsékletek (TMs) között kell, hogy legyen.
A mennyiségi meghatározás módszerei
Szabványgörbék
Az abszolút és a relatív mennyiségi meghatározáshoz egyaránt szükség van szabványgörbékre. Standardgörbék készítésekor különböző DNS-koncentrációkat (általában ötöt) kell használni az ismeretlen koncentrációját záró standardgörbe létrehozásához. Minden koncentrációt két példányban kell lefuttatni.
Abszolút és relatív mennyiségi meghatározás
Ez a SYBR Green PCR-készlet a cél-DNS abszolút vagy relatív mennyiségi meghatározás segítségével történő mennyiségi meghatározására használható. Az abszolút mennyiségi meghatározási technikák a kiindulási mintában lévő cél-DNS mennyiségének meghatározására szolgálnak, míg a relatív mennyiségi meghatározás a cél-DNS mennyisége és egy referenciaamplikon közötti arányt határozza meg. Az ideális referenciaamplikon változatlan, konstitutív expresszióval rendelkezik. A gyakorlatban erre a funkcióra egy háztartási gént választanak, de vannak más referencia-optikumok is, amelyek jobban megfelelnek a fenti követelményeknek.1
Az abszolút mennyiségi meghatározás külső standardokat használ a célnukleinsav abszolút mennyiségének meghatározásához. A mennyiségi meghatározás során az annealingből adódó különbségek kiküszöbölése érdekében a külső standardok primer-kötőhelyeinek meg kell egyezniük a célszekvenciában találhatóakkal. Az ideális külső standard olyan szekvenciákat tartalmaz, amelyek megegyeznek a célszekvenciával, vagy csak kis mértékben térnek el attól. Az abszolút mennyiségi meghatározáshoz a célszekvencia és a külső standard közötti azonos amplifikációs hatékonyság szükséges. A megfelelő konstrukció vagy amplikon azonosítása után külső standard hígításokból standardgörbét készítünk, amelyet ismeretlen célminták koncentrációjának meghatározására használunk.
A relatív mennyiségi meghatározás lehetővé teszi a mintában lévő célsablon és referenciasablon mennyisége közötti arány kiszámítását. Mivel ez a módszer a célpont mennyiségét egy feltételezhetően változatlan kontrollhoz viszonyítva méri, a relatív qPCR-t leggyakrabban genetikai polimorfizmusok közötti különbségek mérésére használják, például szövetek vagy egészséges és beteg minták között. Ennek a technikának az az előnye, hogy egy belső standard használatával minimalizálhatók a minta előkészítésében és kezelésében előforduló eltérések. SYBR-rendszerek használata esetén a célpont és a belső referencia mennyiségi meghatározását külön reakciókban kell elvégezni.
A relatív mennyiségi meghatározás pontossága a standardok referencia-sablonjának megfelelő megválasztásától függ. A standard variabilitása befolyásolja az eredményeket, ezért a legfontosabb, hogy a standardok megfelelőek legyenek.1 Néhány kutató úgy dönt, hogy nem futtat standardgörbét, és a célpont mennyiségét a referencia töredékeként adja meg, ezt a technikát nevezik összehasonlító kvantitációnak. Alternatív megoldásként feltételezhetjük, hogy a cél és a referencia amplifikációs hatékonysága elhanyagolható, és a célt kizárólag a referenciaszekvenciára meghatározott standardgörbe alapján számszerűsíthetjük. Végül, a relatív mennyiségi meghatározás legpontosabb technikája során a referencia és a célszekvencia amplifikációs hatékonyságát is megmérik, és meghatároznak egy korrekciós tényezőt. Ez a normalizálásnak nevezett folyamat 1 olyan mintát igényel, amely mind a cél-, mind a referencia ismert koncentrációját tartalmazza, és két standardgörbét kell készíteni.
PCR-reakció hatékonyságának meghatározása
A referencia- és a célminta közötti PCR-hatékonyságot úgy határozzuk meg, hogy minden célponthoz hígítási sorozatot készítünk. A referencia CT-értékeit kivonjuk a célmintából, és a CT-értékek e különbségét a templátmennyiség logaritmusával szemben ábrázoljuk. Ha az egyenes meredeksége kisebb, mint ± 0,1, akkor az amplifikációs hatásfokok hasonlónak tekinthetők.
Készülékek
- Kvantitatív PCR eszköz
- Mikrocentrifuga
- Lamináris áramlású elszívó a PCR beállításához (opcionális)
Kellékek
- qPCR SYBR Green Mix - Lásd a qPCR kiválasztási útmutatót (Part 1 és Part 2)
- DNS/cDNS sablon- cDNS reakció hígítva 1:10 a közepesen vagy erősen expresszált célpontok kimutatásához vagy 1:2:1:5 ritka transzkriptumokhoz vagy 10 ng-tól 100 ng gDNS-ig
- Az elő- és fordított primerek munkakoncentrációra hígítva (10µM munkakészlet elegendő a legtöbb vizsgálathoz)
ul> - A legtöbb modellorganizmushoz előre megtervezett génexpressziós primerek is rendelkezésre állnak (KiCqStart® SYBR® zöld primerek, KSPQ12012)
Szteril szűrő pipette-tips Steril 1.5 ml-es csavaros tetejű mikrocentrifugacsövek (pl. CLS430909) PCR csövek, válasszon a kívánt formátumnak megfelelő csöveket: PCR minőségű víz (W1754)
Szabványgörbék
Protokoll
Előkészítés
- Tegyen minden reakciókomponenst jégre.
- Keverje össze, majd rövid centrifugálással gyűjtse össze a cső alján lévő tartalmat.
Szokásos SYBR Green I festékreakció
Megjegyzés: Megfigyeléseink szerint a KiCqStart ReadyMixben végzett próbák akkor optimálisak, ha nagyobb primerkoncentrációt használunk, mint a hagyományos PCR-ben. Az alábbi protokollokban 450 nM végkoncentrációt használunk, amely a megfigyeléseink szerint több független vizsgálatnál is optimális koncentrációnak bizonyult.
1. A Primer-próbák során a Primer-próbák a következő koncentrációval kezdődnek. Készítsen elegendő mesterkeveréket az összes minta kétszeres lefuttatásához.
a. Ügyeljen arra, hogy a duplikált minta nélküli negatív kontrollokat (NTC) is tartalmazza.
b. A kiválasztott qPCR-reagens alapján válassza ki az alábbi megfelelő táblázatot.
c. Számítsa ki a keverendő reagensek mennyiségét. Adjon hozzá 10% térfogatot a pipettázási hiba figyelembevételéhez
d. Keverje jól össze, elkerülve a buborékok képződését.
Mesterkeverék a KiCqStart reagensekhez:
Mesterkeverék más teljes qPCR kész keverékekhez:
Mesterkeverék qPCR-reagensekhez különálló komponensekkel:
1Az optimális MgCl2 koncentráció 1 és 6 mM között lehet.
2Hivatkozzon Appendix 1 a készülékéhez optimális referenciafesték-koncentráció meghatározásához.
2. Reakciók beállítása:
a. NTC-reakciókhoz adjon 4 μL vizet a reakciócsőbe.
b. Kísérleti reakciókhoz adjon 4 μL cDNS-oldatot a reakciócsőbe.
c. Centrifugáljon röviden minden csövet. Ellenőrizze vizuálisan, hogy minden cső vagy mélyedés alján a megfelelő térfogatú minta van-e.
d. Óvatosan aliquotáljon 16 μL template master mixet minden egyes qPCR-csőbe vagy lemezkútba.
e. Keverje jól össze a reakciókat, és szükség esetén forgassa meg.
f. Fedjük le a csöveket vagy zárjuk le a PCR-lemezt, és címkézzük fel (a műszer követelményeinek megfelelően). (Ügyeljen arra, hogy a címkézés ne takarja el a műszer gerjesztési/detektálási fényútját.)
3. A címkézésnek nem szabad eltakarnia a műszer gerjesztési/detektálási fényútját. Futtassa le a mintákat a műszer gyártójának ajánlásai szerint. Az alábbiakban a standard és a gyors ciklizálásra adunk példákat.
Standard ciklizálási paraméterek:
Gyors kerékpározás paraméterei:
Megjegyzés: Használja a standard disszociációs görbe protokollt (adatgyűjtés).
4. Az adatok elemzésével kapcsolatos útmutatásért olvassa el a műszer kézikönyvét.
1. melléklet
Referenciafesték-koncentrációk, amelyek a műszerekkel való használatra javasoltak. Külön referenciafestékkel rendelkező qPCR-reagensek esetén
Hibaelhárítási útmutató
Az olvasás folytatásához jelentkezzen be vagy hozzon létre egy felhasználói fiókot.
Még nem rendelkezik fiókkal?