Sady ChIC/CUT&RUN
- Interakce protein-DNA a metoda Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)
- Přehled ChIC a CUT&RUN s použitím modifikované mikroskopické DNA nukleázy (MNázy)
- ChIC/CUT&.amp;RUN kits introduction
- Údaje o použití pro ChIC/CUT&RUN kity
- ChIC a CUT&RUN nástroj pro analýzu dat
Interakce protein-DNA a metoda imunoprecipitace chromatinu (ChIP)
Interakce protein-DNA jsou nezbytné pro mnoho biologických procesů, jako je replikace a oprava DNA, transkripce a regulace genové exprese. Pochopení specifičnosti, s níž se proteiny vážou na sekvence DNA za různých fyziologických podmínek, má značný význam. Z mnoha technik zkoumajících interakce proteinů s DNA se k tomu hojně využívá chromatinová imunoprecipitace (ChIP) a to zejména při zkoumání interakcí proteinů s DNA. Když výzkumníci používají ChIP, buňky se zesíťují formaldehydem, chromatin se fragmentuje a solubilizuje a na solubilní chromatin se aplikuje imunoprecipitace. Ačkoli se metody odečítání pro ChIP v průběhu let vyvíjely od koncové PCR až po vysoce výkonné sekvenování, základy ChIP zůstaly nezměněny. Problémy této techniky však přetrvávají, včetně vysokého pozadí, které omezuje citlivost, problémů s velkým množstvím vstupních buněk a artefaktů vyplývajících ze síťování a solubilizace proteinů.
Přehled ChIC a CUT&RUN s použitím modifikované mikroskopické DNA nukleázy (MNázy)
Výzkumníci, kteří čelili problémům spojeným s využitím techniky ChIP při práci s nerozpustnými proteiny, vyvinuli elegantní alternativní strategii označovanou jako chromatinová imunocleavage (ChIC)1. ChIC detekuje vazebná místa transkripčních faktorů v genomu pomocí cílené modifikované mikrokokové nukleázy (MNázy) konjugované s proteinem A (pA-MN) s použitím specifické protilátky. Modifikovaná MNáza specificky štěpí DNA v oblastech interagujících se zájmovým proteinem pouze za přítomnosti iontů Ca2+, což umožňuje řízené štěpení DNA v místě vazby protilátky. Tento přístup umožňuje mapovat proteiny s rozlišením 100-200 bp a vynikající specifičností ve srovnání s konvenčními metodami ChIP 1.
Přizpůsobením se metodě ChIC vědci dále optimalizovali protokol a zkombinovali ChIC s hloubkovým sekvenováním, aby mohli detekovat vazebná místa transkripčních faktorů a modifikace histonů na nativním chromatinu s rozlišením <5 bp. Tato metoda kombinující ChIC s hlubokým sekvenováním se označuje jako Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN)2.
Při metodách ChIC a CUT&RUN se do roztoku uvolňují pouze cílové fragmenty, zatímco většina DNA zůstává, což vede k mimořádně nízké úrovni pozadí (obrázek 1).
Obrázek 1: Přehled metod ChIC a CUT&RUN.Pro provedení ChIC a CUT&RUN se buňky odebírají a vážou na magnetické kuličky potažené konkanavalinem A. Buněčné membrány se permeabilizují digitoninem, aby specifická protilátka mohla najít svůj cíl. Po inkubaci s protilátkou se kuličky krátce promyjí a inkubují s pA-MN. Buňky se zchladí na 0 °C a přidáním inkubačního pufru obsahujícího Ca2+ se zahájí trávení. Reakce se zastaví chelatací a ze supernatantu se extrahují fragmenty DNA uvolněné do roztoku štěpením.
Výsledkem je, že ChIC a CUT&RUN poskytují vysoce kvalitní data za použití pouhých 100 buněk pro analýzu modifikace histonů a 1 000 buněk pro analýzu vazebných míst transkripčních faktorů. Na rozdíl od ChIP se u ChIC a CUT&RUN nevyskytují problémy s rozpustností a artefakty přístupnosti DNA způsobené síťováním. ChIC a CUT&RUN předčí ChIP z hlediska rozlišení, poměru signálu k šumu a potřebné hloubky sekvenování. Níže je uvedena souhrnná tabulka výhod ChIC a CUT&RUN ve srovnání s X-ChIP-seq (tabulka 1).
Představení souprav ChIC/CUT&RUN
Vyvinuli jsme tři soupravy ChIC/CUT&RUN (Cat. #: CHR100-102)" založené na technikách ChIC a CUT&RUN s přídavkem proteinového koktejlu pG-MN nebo pA-MN/pG-MN, který poskytuje více možností výběru protilátek. pA-MN má vyšší afinitu k většině protilátek, včetně králičího IgG, zatímco pG-MN je vhodnější pro protilátky, které mají nízkou afinitu k proteinu A, například myší IgG1.
Tyto soupravy poskytují následující výhody pro vaše celogenomové profilování interakcí chromatinových proteinů:
- Výjimečně nízký poměr signálu k šumu ve srovnání se síťováním ChIP-seq
- Odstranění síťování, sonikace a vysokorychlostního odstřeďování
- Snížení potřebného počtu výchozích buněk (minimálně 100 buněk pro modifikaci histonů a 1 000 buněk pro transkripční faktor)
- Výrazné zkrácení doby postupu - od buněk k purifikované DNA vše během jednoho dne (minimálně 3 hodiny)
- Není potřeba žádné speciální vybavení
Soupravy ChIC/CUT&RUN lze použít pro mnoho základních lze použít pro mnoho základních a translačních aplikací, pro které je k dispozici pouze omezený počet buněk (standardní cross-linking ChIP protokoly nejsou pro tuto aplikaci vhodné), jako jsou studie vývojové biologie a analýza klinických vzorků nebo buněk získaných po fluorescenčně aktivovaném třídění buněk nebo pitvě. Díky eliminaci sonikace a vysokorychlostních kroků odstřeďování k odstranění nerozpustných materiálů a navázání buněk na magnetické kuličky, lze tyto soupravy ChIC/CUT&RUN potenciálně použít i pro vysoce výkonné aplikace.
Udaje o použití souprav ChIC/CUT&RUN
Níže jsou uvedeny výsledky sekvenování po provedení testu ChIC a CUT&RUN pomocí souprav ChIC/CUT&RUN (obrázek 2-3).
Obrázek 2: Výsledky sekvenčního testu ChIC a CUT&RUN (H3K27me3).ChIC a CUT&RUN test byl proveden s protilátkou anti-H3K27me3 a 2x105 buňkami (1. stopa). Výsledky byly porovnány s publikovanými výsledky testu CUT&RUN (2. stopa) a s daty ChIP-seq z ENCODE (3. stopa). 2. Výsledky anti-H3K4me3 ChIP-seq z ENCODE jsou uvedeny také jako negativní kontrola (4. stopa).
Obrázek 3.Výsledky sekvenčního testu ChIC/CUT&RUN (CTCF). Test ChIC a CUT&RUN byl proveden s protilátkou anti-CTCF (kat. č.: 07-729) a 2x105 buňkami K562 (1. stopa). Tyto výsledky byly porovnány s publikovanými výsledky testu CUT&RUN (GSE104550) (2. stopa) a s daty ENCODE ChIP-seq (GSM749690) se stejnou protilátkou (3. stopa). 2. Výsledky testu CUT&RUN (GSE104550) (2. stopa).
ChIC a CUT&RUN Data Analysis Tool
Chápeme, že i po úspěšném provedení experimentu ChIC a CUT&RUN se můžete setkat s problémy při zpracování a analýze výsledných dat.Proto jsme vytvořili nástroj pro analýzu dat ChIC a CUT&RUN, který vám umožní provádět analýzu dat samostatně. Tento nástroj byl vyvinut na základě běžně používaných a ověřených algoritmů, jako je MACS2 pro volání píků, s ohledem na nepřítomnost nebo přítomnost replikátů a čárových kódů. Nástroj se velmi snadno používá, nevyžaduje předchozí zkušenosti s bioinformatikou, a je pro zákazníky soupravyChIC/CUT&RUN zdarma.
Další informace naleznete v Přehledu nástroje pro analýzu dat ChIC a CUT&RUN a v Často kladených dotazech k nástroji pro analýzu dat ChIC a CUT&RUN. ID vaší objednávky naleznete na dodacím listu, v potvrzení objednávky nebo jej získáte telefonicky na místním zákaznickém servisu.
Odkazy
Abyste mohli pokračovat ve čtení, přihlaste se nebo vytvořte účet.
Nemáte účet?