Mikrobiologie: Příprava médií

Co je kultivační médium?

Mikroorganismy potřebují ke svému růstu a rozmnožování živiny, zdroj energie a určité podmínky prostředí. V přirozeném prostředí se mikrobi přizpůsobili stanovištím, která jsou pro jejich potřeby nejvhodnější. V laboratoři však tyto požadavky musí splňovat kultivační média. Kultivační médium je vodný roztok, do kterého byly přidány všechny potřebné živiny. V závislosti na druhu a kombinaci živin lze vyrobit různé kategorie médií.

Přečtěte si více informací o

• Typy kultivačních médií
• Bílkovinné hydrolyzáty
• Bílkovinné hydrolyzáty
a href="#techniky">Aseptické techniky
• Doplňky médií
/a>
• Interakce složek média

Mikrobiologická kultivační média: DIFERENCIÁLNÍ, SELEKTIVNÍ, KOMPLEXNÍ A DEFINOVANÁ MÉDIA

Selektivní a diferenciální média jsou média založená buď na komplexních, nebo definovaných médiích doplněná o přísady podporující nebo inhibující růst. Přísady mohou být druhově nebo organismálně selektivní. např. specifický substrát nebo inhibitor, jako je cyklohexamid (artidion), který inhibuje růst všech eukaryot a obvykle se používá k zabránění růstu hub ve smíšených kulturách.

Komplexní média jsou bohatá na živiny, které obsahují ve vodě rozpustné extrakty rostlinných nebo živočišných tkání (např, enzymaticky natrávené živočišné bílkoviny, např. pepton a trypton). Obvykle se přidává nějaký cukr, často glukóza, který slouží jako hlavní zdroj uhlíku a energie. Kombinace extraktů a cukru vytváří médium bohaté na minerály a organické živiny, ale protože přesné složení není známo, nazývá se médium komplexní.

Definovaná média jsou média složená z čistých složek v pečlivě odměřených koncentracích a rozpuštěná v dvakrát destilované vodě (tj. přesné chemické složení média je známo). Obvykle obsahují jednoduchý cukr jako zdroj uhlíku a energie, zdroj anorganického dusíku, různé minerální soli a v případě potřeby růstové faktory (přečištěné aminokyseliny, vitaminy, puriny a pyrimidiny).

Kultura Média	Účel
Komplexní	Pěstují většinu heterotrofních organismů
Definováno
/td>	Pěstují specifické heterotrofní organismy a často jsou povinné pro chemoautotrofní organismy, fotoautotrofní organismy a pro mikrobiologické testy
Selektivní	Potlačují nežádoucí mikroorganismy nebo podporují žádoucí mikroorganismy
Podporují růst heterotrofních organismů./td>
Diferenciační	Odlišit kolonie specifických mikrobů od ostatních
Obohacovací	Podobné selektivním médiím, ale navržené tak, aby zvýšilo počet požadovaných mikroorganismů na zjistitelnou úroveň, aniž by stimulovalo zbytek bakteriální populace
Reduktivní	Růst obligátních anaerobů

Směs potřebných živin lze použít jako tekuté médium nebo lze přidat ztužující činidlo. "Agar agar" je přírodní polysacharid produkovaný mořskými řasami a je nejčastěji používaným ztužujícím činidlem přidávaným do médií (koncová koncentrace obvykle 1,5 % w/v). Při podezření na hydrolýzu agaru se jako náhradní zpevňující činidlo používá silikagel.

Bílkovinné hydrolyzáty

Komplexní média často obsahují bílkovinné hydrolyzáty, které jsou vynikajícími přírodními zdroji aminokyselin, peptidů a bílkovin v růstových médiích. Jsou nejdůležitějším zdrojem dusíkatých živin. Nejčastěji se získávají enzymatickým štěpením nebo kyselou hydrolýzou přírodních produktů, jako jsou živočišné tkáně, mléko, rostliny nebo mikrobiální kultury. Množství dostupných bílkovinných hydrolátů, nazývaných také peptony, je obrovské a může podporovat a udržovat růst většiny běžných organismů. K enzymatickému trávení se často užívá papain, pepsin, trypsin nebo směs enzymů pankreatické šťávy. Níže uvádíme seznam často používaných výrazů a jejich definice.

Termín	Vysvětlení
Tryptograficky zpracováno./td>	Bílkovinný hydrolyzát vznikl štěpením bílkovin trypsinem
Pepticky štěpený
Bílkoviny trávené pepsinem	Bílkoviny byly tráveny směsí enzymů pankreatické šťávy
Proteinový peptonet	Směsný enzymatický trávicí prostředek masných bílkovin. Je bohatá na peptidy s vyšší molekulovou hmotností.
Trypton	Kasein, který byl trypticky natráven
Tryptosa/Tryplosa	Smíšený enzymaticky natrávený živočišný protein. Podmínky trávení jsou takové, že obsahuje mnoho různých peptidů včetně peptidů s vyšší molekulovou hmotností (proteosy).

ASEPTICKÉ TECHNIKY POUŽÍVANÉ V MIKROBIOLOGICKÝCH LABORATOŘÍCH

Před očkováním je důležité udržovat sterilní stav mikrobiologického média a všech materiálů, se kterými se setkává. Při jakékoli následné manipulaci s bakteriálními kulturami je třeba vyloučit nežádoucí nebo kontaminující organismy použitím aseptických technik.

Sterilizace znamená zničení všech mikroorganismů včetně spor, toho se dosahuje pomocí tepla, chemikálií, záření a filtrace.

Sterilizace teplem

Sterilizace teplem způsobuje denaturaci a koagulaci životně důležitých proteinů. Je jednoduchá na použití, účinná, snadno kontrolovatelná a nákladově efektivní. Existují různé formy tepelné sterilizace.

• Červený žár: Inokulační drátky nebo smyčky se sterilizují tak, že se drží v Bunsenově plameni, dokud nejsou červené.
• Vlhký žár: Bakterie se snáze ničí vlhkým žárem (párou) než suchým žárem. Obvykle se používá ke sterilizaci kultivačních médií, vodných roztoků a k ničení vyřazených kultur. Aby bylo dosaženo teploty 121 °C nezbytné pro úspěšnou sterilizaci, musí být nejprve odstraněn vzduch. Toho se dosáhne použitím autoklávu (technická verze tlakového hrnce), který se řídí automatickými cykly zahřívání pod tlakem po požadovanou dobu.
• Suchý ohřev: Obvykle se používá pro materiály, které by mohly být buď zkorodovány párou, nebo musí zůstat před použitím suché. Patří mezi ně kovové nástroje, skleněné Petriho misky, baňky a pipety a vata. V praxi vyžaduje sterilizace suchým teplem delší časové intervaly a vyšší teploty než sterilizace párou (např. sterilizace párou 121 °C po dobu 15 minut nebo sterilizace suchým teplem 160 °C po dobu 120 minut).

Chemická sterilizace

Chemická sterilizace se obvykle používá pro choulostivé vybavení, jako jsou optické přístroje a elektrická zařízení, které by se jinak teplem poškodily. Vzhledem k toxicitě používaných chemikálií se nejedná o nejoblíbenější formu sterilizace. Mezi používané chemické látky patří plynný ethylenoxid, který alkyluje aminoskupiny, sulfhydrylové, karboxylové a hydroxylové skupiny mikrobiálních buněčných sloučenin, formaldehyd používaný jako fumigant a páry peroxidu vodíku používané při aseptickém balení.

Sterilizace zářením

Záření se používá u materiálů citlivých na teplo a u vzorků životního prostředí, jako je půda a sediment, kde je třeba zabránit strukturálním změnám způsobeným teplem. Používají se dvě formy záření:

• UV sterilizace iniciuje excitaci atomů, která u nukleových kyselin vede k fatálním mutacím. UV záření nemůže proniknout do materiálů, takže se používá hlavně pro povrchovou úpravu (např. laminy s laminárním prouděním a vzduch a voda).
• Ionizující záření může proniknout do vzorků a způsobit ionizaci uvnitř buněk. Záření gama generované prostřednictvím ⁶⁰Co se používá ke sterilizaci složitých matric, jako je půda a potraviny. Mikroorganismy vykazují zvýšenou odolnost vůči záření v anoxických podmínkách (2-5x) a ve zmrazených vzorcích.

Sterilizace filtrací

Sterilizace filtrací funguje spíše na základě vyloučení než zničení mikroorganismů. Je bezpečná pro uživatele a používá se pro citlivé kapaliny a plyny. V současné době se používají tři typy filtrů:

• Hloubkové filtry jsou vyrobeny ze sloupců naplněných vláknitými materiály, jako je skelná vata nebo vata. Kroutící se a otáčející se vlákna zachycují částice a fungují jako filtry; vykazují malý odpor při průtoku a používají se hlavně pro plyny nebo jako předfiltry pro membránové filtry, které se snadno ucpávají.
• Membránové filtry působí tak, že částice prosévají. Jejich účinnost závisí na velikosti membránových pórů a přítomné elektrostatické přitažlivosti. Nejčastěji používané filtry v mikrobiologii jsou obvykle vyrobeny z acetátu celulózy nebo nitrátu celulózy. Membránová filtrace se obvykle používá pro látky citlivé na teplo, např. roztoky vitaminů; filtry se před použitím tepelně sterilizují.

Velikost pórů filtru potřebných k odstínění:
Kvasnice	0.45 -1.2 µm
Bakterie	0.2 µm
Viry a mykoplazmy	0.01-0,1 µm

• Filtry Nuclepore (Nucleation Track) se skládají z velmi tenkých polykarbonátových fólií, které byly ošetřeny jaderným zářením a poté vyleptány chemickou látkou, aby se vytvořily velmi rovnoměrné vertikální otvory. Používají se pro stejný materiál jako membránové filtry, ale snadněji se ucpávají.

Doplňky médií

Tabulka nejčastěji používaných doplňků médií, způsobů sterilizace a rozpustnosti.

Látka	Rozpustnost ve vodě při 25 °C	Komentář/Sterilizace
Aktidion (cyklohexamid)	2.1 g/100 ml	Zničí se varem ve vodném roztoku o pH 7 po dobu 1 hodiny. Sterilizuje se filtrem
L(+)-Arabinosa	1 g/1 ml
Arginin*	15 g/100 ml	Sat. roztok bly alkalický, absorbuje CO2 pK1, 2.18 pK2 9,09 pK3 13,2
Asparagin*	2.16 g/100 ml	Stabilní ve vodném roztoku při 100 °C, hydrolyzuje v kyselých roztocích
Biotin	22 mg/100 ml	PH 0.01% roztoku = 4.5 kyselé roztoky lze tepelně sterilizovat
Cystein*	rozpustný	Neutrální mírně alkalický roztok se oxiduje na cystin pK1, 1.71 pK2  8,33 pK3 10.78
Dextrin	rozpustný ve 3 dílech vroucí vody	.
Ehrlichovo činidlo Fruktóza	rozpustná rozpustná
Fuchsin	1 g/7 ml
Galaktóza		a) rozpustná v 0.5 dílů vody, volně rozpustná v horké vodě b) rozpustná v 1,7 dílu vody při 17 °C
Glukóza	1 g/1 ml	pH 0,5 M aq roztoku = 5.9
Glycerol	mísitelný
Glykogen	rozpustný	s opalescencí
Laktosa	21.6 g/100 ml	a) 1 g/5 ml b) 1 g/2.2 ml při 15 °C
Maltóza	rozpustná	mp 102-103°.C
Mannitol	rozpustný
Niacin	rozpustný	Stabilní při autoklávování při 120 °C po dobu 20 minut
Ornitin*	rozpustný	Vodný roztok alkalický pK, 1.94 pK2 8,65 pK3 10.76
Fenylalanin*		L 29,6 g/l při 25 °C D 1 g/35,5 ml při 16 °C DL 14.11 g/l při 25 °C pK1 2,58 pK2 9.24
Resazurin	nerozpustný ve vodě	Indikátor 0.1 g ve 20 ml 1 N NaOH + voda do 500 ml pH 3,8 = oranžová, pH 6.5 tmavě fialová
Ribosa	rozpustná
Kyselina citronová	rozpustná 59.2 % při 20 °C	pH 0.1 N roztoku = 2.2
Sorbitol	rozpustný až z 83 %	mp 100/112 °C
Sorbitol	rozpustný až z 83 %	mp 100/112 °C
tr>	Škrob	nerozpustný
Sacharóza	1g/0.5ml
EDTA (disodná sůl)	rozpustná	používá se ke komplexaci železa v médiích
EDTA (kyselina)	používá se ke komplexaci železa v médiích
EDTA (kyselina)	nerozpustná

Všechny zásobní roztoky aminokyselin lze autoklávovat při 120 °C po dobu 20 minut.

Interakce složek média

Při výzkumu, kde hraje důležitou roli složení média (např.např. studie toxicity), je třeba dbát na různé interakce, které mohou probíhat mezi složkami média.

Mediální komponenty	Typ reakce
Kvasinky, pepton a aminokyseliny	Vážou velké množství dvojmocných iontů Hg, Pb, Ag a Cu
Glukóza	vykazuje neselektivní vazbu kovů, která může způsobit nedostatek kovů nezbytných iontů nebo snížit toxicitu toxických iontů.
EDTA	chelatuje esenciální stopové kovy a způsobuje jejich nedostatek; účinek lze zvrátit přidáním jiných kovů, např.Cu a Fe.
NaCI	zvyšuje toxicitu Zn (tvorba Zn-chloro komplexu), snižuje toxicitu Cd.
Agar	v pevném prostředí zvyšuje toxicitu Sn (tvorba rozpustného toxického komplexu tinagar).
Silikagel	snižuje toxicitu dvojmocných iontů Sn, Cd, Pb, Ni a Zn.
Fosfát	srážení* nerozpustných fosforečnanů snižující toxicitu toxických iontů
	(např.Cd a Pb) nebo způsobující nedostatek esenciálních iontů (např. Fe)
Uhličitany	srážení nerozpustných uhličitanů snižuje toxicitu Pb
Citráty	neselektivní vazba kovů
Tris	neselektivní vazba kovů

* Může se tomu zabránit přidáním pufru HEPES, který sníží obsah fosfátů.