Úvod do mikrobiologie

Přečtěte si více o

• Požadavky na růst mikrobů
• .Fyzikální faktory / faktory prostředí
• Taxonomie a identifikace mikroorganismů
• .Monitorování růstu mikroorganismů
• Zachování bakteriálních kultur
• Reference & Literatura

Původním cílem všech mikrobiologů je reprodukovatelný růst jejich mikrobiálních kultur, a to bez ohledu na to, zda jsou mikroorganismy přirozeného původu nebo byly geneticky upraveny člověkem. Reprodukovatelný růst vyžaduje definované podmínky prostředí s ohledem na zdroj energie, teplotu, pH a živiny (Požadavky na růst mikrobů). S ohledem na to dodáváme řadu produktů a služeb (viz seznam sbírek kultur, srovnání médií atd.), které jsou navrženy tak, aby splňovaly potřeby běžných mikrobiologů i specialistů.

Mikroorganismy

Ve skupině organismů klasifikovaných jako mikroorganismy existují jednoduché jednobuněčné formy (koky, bacily, viry a spirily) i mnohobuněčné formy (vlákna a pochvy). Do této skupiny patří sinice (cyanobakterie), houby, prvoci a bakterie.

Mikroorganismy ke svému přežití a růstu potřebují zdroj energie a potravy. Bakterie jsou nejprimitivnější formy mikroorganismů, ale skládají se z velkého množství jednoduchých i složitých molekul a jsou schopny provádět širokou škálu chemických přeměn. V závislosti na svých požadavcích a použitém zdroji energie se dělí do různých výživových skupin.

Obrázek 1.

Velikost mikroorganismů se pohybuje od zlomku μM u virů, které lze pozorovat pouze v elektronovém mikroskopu, až po několik cm například u vláknitých řas nebo hub:

Tabulka 1.

Organismy	Rozsah velikosti (μM)	Příklad (velikost v μM)
Prokaryota
Bakterie: typická tyčinka	1.0-0,5 x 1,0-10	Pseudomonas aeruginosa (1,5 x 0.5)
Bakterie: typická koule	průměr 1,0	Bacillus megaterium (7,6 x 2.4)
Eukaryota
Houby: vláknité	8-15 x 4-8	Mucor hiemalis (průměr 8)
Houby: kvasinkové buňky		Saccharomyces cerevisiae (29-49.1 μM3)
Řasa	28-32 x 8-12	Chlamydomonas
Viry
Virus	0.015 x 0,3	Poliovirus (0,03 x 0,03)
		Tobacco mosaic (0.02 x 0,3)

Požadavky na růst mikrobů

Růst mikrobů vyžaduje vhodné podmínky prostředí, zdroj energie a výživu. Tyto požadavky lze rozdělit do dvou kategorií, na fyzikální a chemické.

Chemické faktory

Tabulka prvků potřebných pro mikrobiální růst, jak se vyskytují v přírodě, v porovnání s chemickými formami dodávanými do mikrobiologických médií.

Tabulka 2.

Požadavky na růst	Forma obvykle se vyskytující v přírodě	Chemická forma běžně přidávaná do mikrobiologických médií
Uhlík	Dioxid uhličitý (CO2), HCO.3- organické sloučeniny	Organické; jednoduché cukry, např.Např. glukóza, acetát nebo pyruvát; extrakty, jako je pepton, trypton, kvasničný extrakt atd. Anorganické; oxid uhličitý (CO2) nebo hydrogenuhličitanové soli (HCO3-)*
Vodík	Voda (H2O) organické sloučeniny
Kyslík	Voda (H2O), plynný kyslík (O2), organické sloučeniny
Dusík	Amoniak (NH3), dusičnany (NO3-) organické sloučeniny e.g. aminokyseliny plynný dusík (N2)	Organické; aminokyseliny, dusíkaté báze anorganické; NH4CI, (NH4./sub>)2S04, KNO3, a u látek vázajících dinitrogen N2S04sub>2
Fosfor	Podstatné složky fosforu	KH2PO4, Na2HPO4*
Síra	Sírovodík(H2S), sírany (SO42-), organické sloučeniny např.g cystein	Na2SO4, H2S	Na2SO, H2S/td>
Draslík	K+	Draslík
Hořčík	Mg2+	MgCI2, MgSO4
Vápník	Ca2+	CaCI2, Ca(HC03)2*
Sodík	Na+	NaCI
Železo	Fe3+ organické komplexy železa/td>	FeCI3, Fe(NH4)(SO4)2, Fe-cheláty1)
Závadné prvky/td>	Obvykle přítomné ve velmi nízkých koncentracích	CoCI2, ZnCI
Organické růstové faktory	Obvykle přítomny ve velmi nízkých koncentracích	Vitamíny, aminokyseliny, puriny, pyrimidiny

*Působí také jako pufry.
¹Pro usnadnění solubilizace nebo zadržení železa v roztoku lze do média přidat komplexotvorné látky, jako je EDTA nebo citrát.

Fyzikální faktory / faktory prostředí

Teplota

Většina mikroorganismů dobře roste při běžných teplotách, které jsou příznivé pro člověka, vyšší rostliny a živočichy. Některé bakterie však rostou při teplotách (extrémní teplo nebo chlad), při kterých může přežít jen málo vyšších organismů. V závislosti na preferovaném rozsahu teplot se bakterie dělí do tří skupin: Psychrofily (chladnomilné mikroorganismy), které se vyskytují především v hlubinách oceánů, v ledu a sněhu a v arktických oblastech, mají optimální teplotu růstu mezi 0 °C a 15 °C a maximální teplotu růstu nejvýše 20 °C. Mezofily (bakterie milující střední teplotu), které se vyskytují ve vodě, v půdě a ve vyšších organismech, jsou nejběžnějším typem studovaných mikrobů. Jejich optimální růstová teplota se pohybuje mezi 25 °C a 40 °C. Optimální teplota pro mnoho patogenních bakterií je 37 °C, takže mezofily tvoří většinu našich běžných mikrobů způsobujících kažení a nemoci. Termofilové (mikrobi milující teplo) jsou schopni růstu při vysokých teplotách s optimem nad 60 °C. Některé organismy rostou při teplotách blízkých bodu varu vody a pod tlakem dokonce při teplotách nad 100 °C. Většina termofilů nemůže růst při teplotě nižší než 45 °C.

pH

Většina bakterií roste nejlépe v prostředí s úzkým rozmezím pH blížícím se neutralitě mezi pH 6,5 a 7,5. Bakterie jsou schopny růst při teplotách nižších než 45 °C. Ty, které rostou v extrémních hodnotách pH, se řadí mezi acidofily (kyselomilné) nebo alkalinofily (bazikomilné). Acidofilní bakterie rostou při hodnotách pH nižších než 4, přičemž některé bakterie jsou aktivní i při pH 1. Alkalinofilní bakterie preferují hodnoty pH 9-10 a většina z nich nemůže růst v roztocích s pH neutrálním nebo nižším. Během růstu bakterií se často do média uvolňují organické kyseliny, které snižují jeho pH, a tak narušují nebo zcela brání dalšímu růstu. Ačkoli běžné složky média, jako jsou peptony a aminokyseliny, mají malý pufrovací účinek, ve většině bakteriologických médií je k neutralizaci kyselin a udržení správného pH zapotřebí vnější pufr. Fosforečnanové soli jsou nejčastěji používanými pufry, protože pufrují v růstovém rozmezí většiny bakterií, nejsou toxické a poskytují zdroj fosforu, základního živného prvku. Vysoká koncentrace fosforečnanů má však tu nevýhodu, že může vést k silnému omezení živin způsobenému vysrážením nerozpustných fosforečnanů kovů (např. železa) v médiu.

Osmotický tlak

Mikrobi obsahují přibližně 80-90 % vody, a pokud jsou umístěni do roztoku s vyšší koncentrací rozpuštěných látek, ztrácejí vodu, což způsobuje smršťování buňky (plazmolizaci). Některé bakterie se však vysokým koncentracím solí přizpůsobily natolik dobře, že je pro svůj růst skutečně vyžadují. Tyto bakterie se nazývají halofily (slanomilné) a vyskytují se v solných lázních nebo v oblastech, jako je Mrtvé moře.

Tabulka 3.

Faktor	Třída organismu	Minimum	Optimum	Maximum	Příklad
Teplota (°C)	extrémní psychrofil	-2	5	10	Raphidonema nivale (sněžná řasa)
	psychrofil	0	15	20	Vibrio marinus
	mezofilové	10-15	24-40	35-45	Escherichia coli
	fakultativní termofil	37	45-55	70
	obligátní termofil	45	70-75	85-90	Thermus aquaticus
	extrémní termofil	60	75-80	85-110	Sulfolobus acidocaldarius
pH	acidofil	0.8	2-3	5	Thiobacillus thiooxidans
	alkal(in)ophile	ca 7	9-10.5	11-11.5	Bacillus alcalophilus
Osmotický tlak	halophile	0.5	1-2	4-4.5	Vibrio costicola
(Molární koncentrace soli)	extrémní halofil	3	3 5	5.2	Halobacterium halobium

Obrázek 2:

Kyslík

Mikrobi, kteří využívají kyslík k získávání energie, se nazývají aeroby, pokud ke svému metabolismu kyslík potřebují, nazývají se obligátní aeroby. Obligátní aeroby jsou v nevýhodě, protože kyslík je špatně rozpustný ve vodě a ve velké části prostředí je tohoto nezbytného prvku nedostatek. Aerobní bakterie si často zachovaly schopnost růst bez kyslíku; tyto bakterie se nazývají fakultativní anaeroby. Bakterie, které nejsou schopny využívat kyslík a ve skutečnosti jim může škodit, se nazývají obligátní anaeroby. Mezi další skupiny patří: mikroaerofilové, což jsou aerobní mikrobi, kteří tolerují pouze úzké pásmo koncentrací kyslíku, obvykle nižší než v atmosféře, a proto je často obtížné je kultivovat v laboratoři, a aerotolerantní bakterie, které rostou v přítomnosti kyslíku, ale nevyžadují ho.

Voda

Na rozdíl od vyšších organismů je metabolismus mikroorganismů závislý na přítomnosti vody. Požadavky mikroorganismů s ohledem na dostupnou vodu se značně liší. Pro porovnání obsahu dostupné vody v pevných látkách a roztocích jsou užitečnými parametry aktivita vody nebo relativní vlhkost.

Dioxid uhličitý

Mikrobi při autotrofním metabolismu zachycují různé zdroje energie a redukční síly, které využívají k redukci CO₂ na organické sloučeniny. Pokud se mají pěstovat autotrofní mikroorganismy vázající CO₂, přidává se do kultivačního média obvykle hydrogenuhličitan sodný a inkubace probíhá v atmosféře obsahující oxid uhličitý v uzavřených nádobách, případně v nádobě cirkuluje vzduch nebo vzduch obohacený oxidem uhličitým. Zatímco některé chemoautotrofy jsou aerobní, využívají kyslík jako konečný akceptor elektronů a získávají energii z respirace různých anorganických donorů elektronů, jiné mikroorganismy se zapojují do anaerobní respirace a využívají anorganický konečný akceptor elektronů jiný než kyslík. Heterotrofní (= asimilující organické zdroje uhlíku) mikroorganismy vyžadují také oxid uhličitý. Mnohé bakterie žijící v krvi, tkáních nebo ve střevním traktu jsou přizpůsobeny vyššímu obsahu oxidu uhličitého, než je v běžném vzduchu. Tyto bakterie se proto inkubují v atmosféře obsahující 10 % (obj.) oxidu uhličitého. Fototrofní bakterie jsou obligátní anaeroby a využívají energii ze světla k řadě reakcí, při nichž se oxid uhličitý přeměňuje na triosafosfát a další složky buňky. Přestože je oxid uhličitý spíše recyklován než asimilován, téměř všechny rostoucí buňky mají absolutní požadavek na odpovídající pCO₂. Je proto důležité si uvědomit, že odstranění oxidu uhličitého, např. absorpcí KOH, inhibuje růst téměř všech bakterií.

Mikrobiologické kultivační metody & izolace mikroorganismů z přírody

Mikroorganismy lze izolovat z jejich přirozeného prostředí pomocí různých technik. Pokud jsou mikrobiální populace časté, husté nebo dostatečně velké, lze z nich odebrat vzorky přímo sterilním tamponem nebo kličkou a naočkovat je do vhodného tekutého média nebo je rozetřít na agarovou plotnu. To platí zejména pro lékařské vzorky, v nichž jsou organismy přítomny ve velkém množství a v lokalizovaných oblastech. Vzorky životního prostředí s velkou mikrobiální populací, např. půda, mohou být také přidány přímo do vhodného média. Tam, kde se mikroorganismy vyskytují zřídka, je nutné provést předběžnou zastávku obohacování. Toho se dosáhne přefiltrováním vzorků a inkubací filtrů ve vhodném médiu. Filtrace se běžně používá u kapalných vzorků (např. říční a mořské vody) a při odběru vzorků vzduchu. Odběr vzorků životního prostředí in situ zahrnuje techniky, jako jsou metody zakopaných sklíček nebo zakopaných kapilár, při nichž se mikroskopická sklíčka nebo kapiláry potažené vhodným médiem zakopou v přírodním prostředí (půdě nebo sedimentu) a vyjmou se až po určité době. Sklíčka nebo kapiláry se poté přidají do čerstvého média a organismy se dále kultivují. Tyto metody se používají v případě, že organismy rostou pomalu, vyžadují zvláštní podmínky nebo je nutné minimální narušení prostředí.

Všechny vzorky lze podkulturovat pomocí některé z uvedených mikrobiologických kultivačních metod.

Obrázek 3.

Taxonomie a identifikace mikroorganismů

Taxonomie je teorie a praxe klasifikace jedinců do skupin. Existují tři skupiny taxonomických metod:

Numerická taxonomie

Tato je definována jako "seskupování taxonomických jednotek numerickými metodami do taxonů na základě jejich vlastností". Zahrnuje studium všech fyziologických znaků bakterií pomocí řady biochemických a kultivačních testů, jako jsou: rozmanitost rozkládaných organických sloučenin, požadavek na různé vitamíny nebo koenzymy, reakce barvení a inbitice růstu antibiotiky. Výsledky jsou kódovány na počítači a vztahy mezi jedinci jsou vyjádřeny jako dendrogram. Tato forma taxonomické klasifikace neodkazuje na evoluční vztahy mezi bakteriálními kmeny. V současné době jsou komerčně dostupné soupravy obsahující mnoho těchto testů, které usnadňují identifikaci několika skupin bakterií.

Chemická taxonomie

Zařazení jedinců do skupin se provádí v závislosti na souboru znaků, u nichž se předpokládá, že jsou zděděny od společného předka. V případě chemické taxonomie se bakterie seskupují podle chemické podobnosti strukturních složek bakterií. Nejčastěji se používají proteiny, což jsou molekuly, které se během evoluce dobře zachovaly. Pro stanovení společného původu chemotaxonomové běžně analyzují primární strukturu enzymů, peptidogylkan, cytoplazmatickou membránu a složení jejích mastných kyselin, vnější membránu a konečné produkty metabolismu.

Molekulární taxonomie

Jedná se o porovnání genetických sekvencí chromozomální DNA nebo ribozomální RNA za účelem stanovení vzorců podobnosti a fylogenetického vývoje skupiny. Přestože se obsah purinových (G, guanin; A, adenin) a pyrimidinových (C, cytosin; T, tymin) bází v DNA u jednotlivých jedinců liší, v rámci daného druhu zůstává konstantní. Obsah G+C lze proto použít k určení taxonomických vztahů.

Podobnosti mezi sekvencemi 16S nebo 23S ribozomální RNA se také porovnávají za účelem studia fylogeneze skupiny bakterií.

Testování antimikrobiální citlivosti

Antimikrobiální aktivita sloučeniny se obvykle určuje měřením nejnižší koncentrace sloučeniny, která je potřebná k inhibici růstu testovaného mikroorganismu (MlC-minimální inhibiční koncentrace). Testy se opírají o difúzi antibiotika mikrobiálním prostředím, které inhibuje růst citlivého organismu rostoucího v něm nebo na něm. Inhibiční zóny se považují za reprezentativní pro citlivost mikroba. Citlivost na antibiotika se již mnoho let používá jako charakteristická metoda pro klasifikaci a identifikaci.

Anaerobní růst

Kultivace striktně anaerobních bakterií představuje zvláštní problém, protože tyto bakterie mohou být usmrceny působením vzduchu. Rozpuštěný kyslík v médiu tvoří za přítomnosti metabolických elektronů toxické volné radikály a peroxid vodíku. Obligátní anaeroby nejsou schopny tyto aktivní formy kyslíku detoxikovat. K pěstování neangažovaných anaerobů na pevném médiu se používají anaerobní nádoby spolu s plynovými generátory "Gas-Paks", které uvolňují CO₂ a H₂. Vodík reaguje s kyslíkem za přítomnosti palladiového katalyzátoru za vzniku vody, čímž se kyslík ze sklenice odstraní. Komerčně jsou dostupné zcela anaerobní komory vybavené vzduchovými zámky a naplněné inertními plyny, které se používají ke kultivaci striktních (obligátních) anaerobů.

Redoxní potenciál (O/R potenciál)

Jedná se o poměr oxidovaných a redukovaných molekul v médiu: když se v médiu rozpustí například kyslík, přítomné organické sloučeniny se více oxidují a médium vykazuje kladný redoxní potenciál. Jak mikrobiální růst spotřebovává kyslík, médium se posouvá k zápornějšímu redoxnímu potenciálu. Striktní anaeroby vyžadují, aby bylo médium během růstu udržováno na velmi nízkém (záporném) potenciálu. K dosažení tohoto cíle se do média před autoklávováním přidávají redukční činidla. Běžně používanými redukčními činidly jsou thioglykolát sodný (HS-CH₂COONa) nebo dithionit sodný, které snadno darují protony jiným sloučeninám. Vztah mezi redoxním potenciálem, pH a mikrobiálním růstem je znázorněn níže.

Obrázek 4.

Rozmezí pH a Eh pro růst mikroorganismů (převzato ze Zajic 1969): obrázek byl sestaven ze zpráv, kde bylo uvedeno pH i Eh pro růstové chování. Je velmi pravděpodobné, že růstové rozsahy jednotlivých skupin přesahují hranice uvedené na obrázku.

Monitorování mikrobiálního růstu

Obrázek 5

Sériové ředění

Inokulum se naředí v sérii ředicích zkumavek, které se rozvrství. Spočítá se počet kolonií na destičce a po korekci na ředění se vypočítá počet organismů v původním inokule.

Metoda nejpravděpodobnějšího počtu

Statistická metoda odhaduje nejpravděpodobnější počet bakterií přítomných v inokule, které bylo použito k vytvoření série ředění. Provede se několik sérií s různými počátečními objemy inokula; výsledky se zaznamenají jako série pozitivních výsledků, tj. růstu ve zkumavce, z nichž lze poté vypočítat MPN. Výsledkem je pravděpodobný počet mikroorganismů, který by měl dát tento výsledek.

Přímé pozorování mikroskopem

Používají se speciálně konstruovaná mikroskopická sklíčka, která mají mělkou jamku o známém objemu a mřížku vyleptanou do skla. Jamka se naplní bakteriální suspenzí a stanoví se průměrný počet bakterií v každém čtverci mřížky a poté se vynásobí koeficientem, čímž se získá počet bakterií na mililitr. Selektivní barvení (s použitím fluorescenčních barviv) se používá k odlišení bakterií od neživého materiálu ve vzorcích životního prostředí. K dispozici jsou také elektronické čítače buněk, které automaticky počítají počet buněk v měřeném objemu kapaliny.

Zákal (optická hustota)

Zákal kapalného prostředí se zvyšuje s množením bakterií a lze jej měřit na spektrofotometru. Množství světla dopadajícího na detektor je nepřímo úměrné počtu bakterií za standardizovaných podmínek. Absorbovatelnost vzorku (optická hustota) je závislá na počtu buněk, jejich velikosti a tvaru a používá se k vykreslení růstu bakterií. Pokud se odečtené hodnoty absorbance porovnají s přímým počítáním téže kultury, jejím obsahem bílkovin nebo sušiny, lze korelaci použít při budoucím odhadu počtu bakterií nebo biomasy založeném přímo na měření zákalu.

Metabolická aktivita

Dalším nepřímým způsobem odhadu počtu bakterií je použití metabolické aktivity populace. Měří se množství metabolického produktu a předpokládá se, že je úměrné počtu přítomných bakterií. Příklady metabolických produktů zahrnují CO₂ a organické kyseliny. Příjem kyslíku lze měřit také redukčním testem, například pomocí barviva methylenové modři, které mění barvu z modré v přítomnosti kyslíku na bezbarvou v jeho nepřítomnosti.

Konzervace bakteriálních kultur

Chlazení

Lze použít ke krátkodobému skladování. Kultury rozetřené na agarových preparátech nebo bodové kultury mohou být životaschopné po dobu několika měsíců, pokud jsou skladovány při teplotě 4 °C . Destičky je třeba uzavřít, aby se zabránilo jejich tendenci k vysychání. Pro uchování kultur po delší dobu se běžně používají dvě metody:

Hluboké zmrazení

Čistá kultura bakterií se suspenduje v tekutině a rychle zmrazí (často tekutým dusíkem) při teplotách mezi -50 °C a -95 °C. Citlivé mikroorganismy vyžadují k ochraně přítomnost glycerolu (koncová koncentrace 15-20 %), který působí jako "nemrznoucí látka", nebo dodatečné bílkoviny (sušené odstředěné mléko). Kultury lze rozmrazit a použít až po několika letech.

Lyofilizace

Suspenze bakterií se rychle zmrazí a voda se odstraní pomocí vysokého vakua. Mikrobi přežívají v těchto práškovitých zbytcích několik let a mohou být kdykoli oživeni rehydratací kultury v živném médiu. Bakteriální kmeny objednané ze sbírek kmenů se obvykle dodávají v této formě.