Protokol buněčných kultur 10: Testování buněk na kontaminaci mykoplazmaty pomocí barvení DNA Hoechstem

ECACC Laboratory Handbook 4th Edition

Cíl

Metody barvení DNA, jako jsou nepřímé Hoechst barvení, jsou rychlé a výsledky jsou k dispozici do 72 hodin, což je v porovnání se 4 týdny u a cute;barvení rychlé.nbsp;Detekce mykoplazmy izolací kultury. Barvení buněčných linií přímo s barvením DNA může poskytnout výsledky do 24 hodin, avšak při mnohem nižší citlivosti (~10⁶ KTJ/ml). To lze zlepšit společnou kultivací testované buněčné linie v přítomnosti indikátorové buněčné linie, jako je Vero. Tento krok obohacení vede k citlivosti 100 cfu/ml kultury a je preferovanou metodou používanou ECACC. Tento krok rovněž zvyšuje citlivost tím, že zvětšuje povrch, na kterém může mykoplazma ulpět. Stejně jako v případě detekce pomocí kultury jsou pro detekci mykoplazmy z buněčných kultur nebo činidel buněčných kultur vhodné metody barvení DNA.

Materiály

• Média pro buněčné kultury: Předehřáté na vhodnou teplotu (správné médium a teplotu naleznete v datovém listu buněčné linie ECACC.)
• Metanol (322415)
• Kyselina octová ledová (A6283)
• Barvicí roztok Hoechst 33342 (B2261)
• Indikátorové buňky např.g. Vero buňky (84113001)
  - Mycoplasma hyorhinis NCTC10130 a
  . - Mycoplasma orale NCTC 10112

Vybavení

• Osobní ochranné pomůcky (sterilní rukavice, laboratorní plášť, ochranný štít)
• Vodní lázeň nastavená na 37 °C
• Mikrobiologická bezpečnostní skříň odpovídajícího stupně utajení
• CO₂ inkubátor nastavený na 37 °C
• Mikroskop (UV Epi-Fluorescence.)
• Miskami na tkáňové kultury
• Více misek s 12 jamkami
• Sklíčky pro mikroskop a 13mm krycími sklíčky
• Sklíčky pro mikroskop a 13mm krycími sklíčky
• Hliníková fólie

Postup

1. Umístěte sterilní krycí sklíčka do misek/plotýnek pro tkáňové kultury, např. 12jamkové destičky.
2. Do připravených misek naočkujte 2 ml indikátorových buněk, např. 2 x 10⁴ Vero buněk na jamku 12jamkové destičky.
3. Inkubujte při 37 °C v 5% CO₂ po dobu 2-24 hodin, aby se buňky přichytily na krycí sklíčka.
4. Připojené testovací buněčné linie uveďte do suspenze pomocí buněčné škrabky. Suspendované buněčné linie mohou být testovány přímo.
5. Odstraňte 1 ml supernatantu kultury z duplicitních jamek a přidejte do každé z nich 1 ml testovaného vzorku. Naočkujte 2 jamky 100 KTJ každého pozitivního kontrolního organismu.
6. Duplikátní jamky s tkáňovými kulturami ponechte neočkované jako negativní kontroly.
7. Inkubujte misky při 37 °C v 5% CO2 po dobu 3-5 dnů.
8. Po 3-5 dnech fixujte buňky na krycím sklíčku přidáním minimálně 2 ml čerstvě připraveného Carnoyova fixativa (1:3 ledová kyselina octová: absolutní metanol) do každé misky a nechte působit 3 minuty. Poté přelejte do láhve s toxickým odpadem. Opakujte ještě jednou. Přidejte minimálně 2 ml barviva Hoechst 0,4 μg/nl. Nechte působit 3 minuty chráněné před přímým světlem, např. zakrytím hliníkovou fólií.
9. Použité a nepoužité barvivo dekantujte do toxického odpadu.
10. Přidejte 1 kapku mountantu na předem označené mikroskopické sklíčko a umístěte na něj krycí sklíčko (buněčnou stranou dolů).
11. Držte sklíčko přikryté hliníkovou fólií a nechte ho ztuhnout alespoň 15 minut při 37 °C nebo 30 minut při pokojové teplotě.
12. Pozorujte sklíčko pod UV Epi-Fluorescencí při 100x.

Kritéria pro platný výsledek

Negativní kontroly nevykazují žádné známky mykoplazmové infekce; Pozitivní kontroly vykazují známky mykoplazmové infekce; Vero buňky jsou jasně vidět jako fluoreskující jádra.

Kritéria pro pozitivní výsledek

Vzorky infikované mykoplazmou jsou vidět jako fluoreskující jádra plus mimojaderná fluorescence mykoplazmové DNA (malé koky nebo vlákna).

Kritéria pro negativní výsledek

Neinfikované vzorky jsou vidět jako fluoreskující jádra na tmavém pozadí. Neměly by se objevit žádné známky přítomnosti mykoplazmy, tj. mimojaderná fluorescence mykoplazmové DNA.

Poznámky

1. DNA barviva, jako je barvivo Hoechst, se specificky vážou na DNA. Ve všech kulturách budou buněčná jádra fluoreskovat. Teoreticky nekontaminované kultury budou vykazovat pouze fluoreskující jádra, zatímco mykoplazma pozitivní kultury obsahují malé koky nebo vlákna, která mohou, ale nemusí být adsorbována na buňky (obrázek 11). Upozorňujeme však, že fluoreskuje i jakákoli cizí DNA, např. zbytky buněk, které jsou někdy mylně považovány za kontaminaci mykoplazmou.
2. Barvivo Hoechst je toxické a mělo by se s ním zacházet opatrně a likvidovat ho.
3. V některých případech může být interpretace výsledků obtížná z následujících důvodů:
   - Bakteriální/kvasinkové/houbové znečištění
   - Příliš mnoho nečistot v pozadí (jako v případě hybridomových buněčných linií)
   - Rozbitá jádra, protože všechny buňky jsou mrtvé
   . - Příliš málo živých buněk nebo žádné
4. Ačkoli tento postup doporučuje použití pozitivních kontrol, nemusí to být nutně proveditelné nebo žádoucí v zařízení pro kultivaci buněk s omezenými zdroji. Pokud mají být použity pozitivní kontroly, měly by být provedeny v laboratoři oddělené od hlavního zařízení pro tkáňové kultury. Pokud se pozitivní kontroly nepoužívají, pak se důrazně doporučuje, abyste si pro pravidelné testování buněčných linií zajistili nezávislou testovací laboratoř.
5. ECACC doporučuje, aby se vzorky testovaly na přítomnost mykoplazmy pomocí nejméně dvou detekčních metod (např. nepřímého barvení DNA a izolace kultury), aby byl výsledek spolehlivější. Důvodem je různá citlivost detekčních metod pro různé druhy mykoplazmy.

ECACC nabízí službu testování mykoplazmy, kde jsou k dispozici tři různé metody detekce, tj. PCR, nepřímé barvení DNA a izolace kultury.