Protokoly pro Fmoc SPPS peptidů obsahujících cystein

Peptidy obsahující Cys mohou existovat buď v redukované (sulfhydrylové), nebo oxidované formě s disulfidovou vazbou mezi řetězci. Syntéza peptidů obsahujících Cys proto představuje pro peptidové chemiky zvláštní výzvu. Má-li být získán peptid se správnou strukturou a s dobrým výtěžkem, je nezbytné pečlivě naplánovat syntetickou strategii. Výběr nejvhodnější sulfhydrylové ochranné skupiny je nesmírně důležitý, protože "špatná" volba může vést k nepřekonatelným potížím při syntéze nebo následné tvorbě disulfidové vazby.

Je důležité si uvědomit, že zde popsané postupy jsou pouze výchozím bodem a nelze zaručit, že budou fungovat ve všech případech. Problémy jsou závislé na sekvenci a často je nutná značná optimalizace reakčních podmínek. Pokud se vyskytnou potíže, náš technický servis vám rád pomůže, kdykoli to bude možné. Pojednání o nakládání s peptidy obsahujícími cystein spolu s podrobnými praktickými protokoly naleznete v odkazu.¹

Cysteinylová ochrana

Pro použití ve Fmoc SPPS (syntéza peptidů na pevné fázi) je k dispozici široká škála cysteinyl-ochranných skupin. Výběr závisí na povaze požadovaného peptidu a syntetické strategii. Přehled thiolových ochranných skupin běžně používaných při Fmoc SPPS (Tabulka 1).

Pro rutinní syntézu cysteinylových peptidů obsahujících volné thiolové skupiny se doporučuje zejména tritylová skupina, která je labilní vůči TFA (kyselina trifluoroctová), a proto je odstraněna během běžného postupu štěpení. Peptid se zpočátku získává v redukované monomerní formě, ale v případě potřeby jej lze snadno převést na dimerní nebo cyklickou formu s disulfidovou vazbou oxidací.

Pro selektivní modifikaci thiolových skupin pryskyřicí nebo tvorbu disulfidů na pryskyřici jsou nejužitečnější STmp a Mmt, protože je lze odstranit za podmínek ortogonálních ke standardním ochranným skupinám postranních řetězců používaným při Fmoc SPPS.

Výběr ochranných skupin pro selektivní tvorbu disulfidů je méně přímočarý a nalezení optimální kombinace může vyžadovat rozsáhlé experimentování. Podrobná diskuse o této problematice je uvedena níže, tvorba disulfidové vazby oxidací chráněných cysteinylpeptidů.

Tabulka 1.

Ochranná skupina	Sklidové činidlo	Komentáře
Acetamidomethyl(Acm)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+, RSCl, PhSOPh-CH3SiCl3	Stabilní vůči TFA. Umožňuje purifikaci peptidu v chráněné formě před uvolněním snadno oxidovatelných thiolových skupin. Odstranění Acm a současnou tvorbu disulfidové vazby lze provést ošetřením I2 nebo Tl3
t-Butyl(tBu)	Hg(II), HF(20 oC), TFA/DMSO, PhSOPh-CH3SiCl3	Stabilní vůči TFA a oxidaci jodem. Při ošetření MeSiCl3/PhSOPh se odstraní t-Bu a cyklizuje se v jednom kroku, aniž by se narušily existující disulfidické vazby. Ošetření DPDS v kyselině vede k přímé tvorbě Cys(Pys) za přítomnosti existujících disulfidických můstků a Cys(Acm).
Trityl(Trt)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+., TFA, I2, Tl3+	Užitečný derivát pro rutinní použití ve Fmoc SPPS, protože generuje sulfhydrylový peptid přímo z reakce štěpení TFA.
Difenylmethyl(Dpm)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+./sup>, TFA, I2, Tl3+	Užitečný derivát pro rutinní použití ve Fmoc SPPS, protože generuje sulfhydrylový peptid přímo z reakce štěpení TFA. Obvykle v kombinaci s Mmt skupinou, protože Dpm nekrvácí při odstraňování Mmt pomocí 2% TFA.
Tetrahydropyranyl(Thp)	Hg2+, Ag+, I2, Tl3+./sup>, TFA, I2, Tl3+	Užitečný derivát pro rutinní použití ve Fmoc SPPS, protože generuje sulfhydrylový peptid přímo z reakce štěpení TFA. Alternativa ke skupině Trt. Při jeho použití dochází k menší racemizaci a b-eliminaci než u Trt.
t-butylthio(StBu)	RSH, R3P	Stabilní vůči TFA za předpokladu, že nejsou použity thiolové scavengery. Byl použit v kombinaci s Acm pro selektivní tvorbu dvou disulfidických vazeb. Odstraňování je však pomalé a pro deprotekci na pryskyřici se upřednostňuje STmp.
Trimethoxyfenylthio(STmp)	.RSH, R3P	Středně stabilní vůči TFA za předpokladu, že nejsou použity thiolové scavengery. Byl použit v kombinaci s Mmt pro selektivní tvorbu dvou disulfidových vazeb na pryskyřici.
4-Methoxytrityl(Mmt)	2% TFA v DCM, Hg2+, Ag+./sup>, I2, Tl3+,	Může být selektivně odstraněn, zatímco peptid zůstává připojen k pevné fázi. Ideální pro tvorbu disulfidových vazeb na pryskyřici nebo modifikaci postranního řetězce Cys.
3-Nitro-2-pyridinesulfenyl(Npys)	RSH, R3P	Stabilní vůči TFA za předpokladu, že nejsou použity thiolové scavengery. Aktivuje thiolové skupiny směrem k tvorbě disulfidové vazby. Použitelný pro selektivní přípravu smíšených disulfidů.

Fmoc SPPS s použitím chráněných derivátů cysteinu

Na rozdíl od jiných aminokyselin chráněných Fmoc mohou deriváty Cys chráněné Fmoc během standardních spojovacích reakcí podléhat významné racemizaci. Problém je obzvláště akutní, pokud se pro aktivaci karboxylu používají metody zprostředkované bází, jako je HBTU/DIPEA. Mikrovlnný ohřev a předběžná aktivace tento problém ještě zhoršují. Naštěstí je racemizace zanedbatelná, pokud se spojování provádí za kyselých/neutrálních podmínek s použitím předem připravených symetrických anhydridů² nebo esterů OPfp³ nebo s aktivací DIPCDI/HOBt nebo DIPCDI/Oxyma.

Syntéza peptidové kyseliny obsahující C-koncový zbytek cysteinu vyžaduje zvláštní pozornost, protože rozsáhlá epimerizacesup>4 a tvorbě β-piperidinylalaninu⁵ může dojít během prodlužování řetězce. Tyto vedlejší reakce jsou nejproblematičtější tam, kde je cysteinový zbytek ukotven na pryskyřici Wangova typu. Naštěstí se zdá, že použití pryskyřic tritylového typu⁶ jako je 2-chlorotritylová pryskyřice, NovaSyn TGT, NovaPEG tritylová pryskyřice, snižuje tyto problémy na přijatelnou úroveň a důrazně se doporučuje pro syntézu peptidových kyselin obsahujících Ckoncový cystein.

Syntéza cysteinylpeptidů

Cys(Trt), Cys(Thp) a Cys(Dpm)

Pro syntézu peptidů obsahujících volné sulfhydrylové skupiny je nejvýhodnější použít Fmoc-Cys(Trt)-OH. Tritylová skupina je labilní vůči TFA, a proto je odstraněna během běžného průběhu štěpné reakce.

Vzhledem k vysoké stabilitě tritylového kationtu a silně nukleofilní povaze thiolové skupiny je tato reakce reverzibilní, a proto je třeba věnovat zvláštní pozornost podmínkám štěpení, aby byla zajištěna úplná deprotekce. Problémy s neúplnou deprotekcí zbytků Cys(Trt) lze obvykle překonat použitím štěpných koktejlů, které obsahují TIS^7a. Toto činidlo je mimořádně účinné při zhášení tritylového kationtu a převádí jej nevratně na trifenylmetan. Může být nahrazen triethylsilanem, i když je třeba dávat pozor u peptidů obsahujících nechráněný tryptofan, protože je známo, že silany způsobují redukci indolů.

U peptidů obsahujících více zbytků Cys(Trt) se nejlepších výsledků dosáhne, pokud se peptid vysráží přímo do diethyletheru ze štěpné směsi TFA. Přidání 2,5 % ethanedithiolu do štěpného koktejlu pomáhá zajistit, aby byl peptid udržován v redukovaném stavu, a minimalizuje vedlejší produkty způsobené alkylací této cysteinové thiolové skupiny. Je nezbytné použít dostatečné množství štěpicího koktejlu pro množství štěpeného peptidu. Obecně stačí 30 ml na 0,5 mmole. (Pokud však peptid obsahuje více Cys zbytků a mnoho t-butylových ochranných skupin, je třeba zvýšit koncentraci EDT nebo objem použitého koktejlu, aby bylo zajištěno účinné odštěpení.

Nedávno byl jako alternativa k Fmoc-Cys(Thp)-OH zaveden Fmoc-Cys(Trt)-OH, kde je sulfhydrylová skupina chráněna kyselinou odbouratelnou tetrahydropyranylovou (Thp) skupinou^7b. Ukázalo se, že použití Fmoc-Cys(Thp)-OH poskytuje lepší výsledky než odpovídající deriváty S-Trt, S-Dpm, S-Acm a S-StBu. U C-koncových cysteinových zbytků připojených k Wangovým pryskyřicím byla při delším ošetření piperidinem pozorována výrazně nižší racemizace a tvorba -piperidinylalaninu. Racemizace během spojení DIPCDI/Oxyma Pure Fmoc-Cys(Thp)-OH byla pouze 0,74 % ve srovnání s Fmoc-Cys(Trt)-OH (3,3 %) a Fmoc-Cys(Dpm)-OH (6,8 %). Úplné odstranění skupiny Thp bylo provedeno působením TFA/voda/TIS 95:2,5:2,5 za 2 hodiny. Skupina Thp je však stabilní vůči 1% TFA v DCM, což usnadňuje syntézu chráněných peptidových fragmentů na hyperkyselých labilních pryskyřicích, jako jsou 2-chlorotritylové nebo HMPB pryskyřice.  První důkazy naznačují, že peptidy S-Thp mají zvýšenou rozpustnost ve srovnání s peptidy chráněnými pomocí Trt.

Fmoc-Cys(Dpm)-OH je cennou alternativou k Fmoc-Cys(Trt)-OH pro zavedení zbytků Cys během Fmoc SPPS^7c. Regioselektivní syntézy cyklických peptidů obsahujících dva disulfidické můstky lze snadno dosáhnout pomocí kombinace Dpm a Mmt sulfhydrylových ochranných skupin. S-Dpm ochrana je stabilní vůči 1 - 3 % TFA, na rozdíl od S-Trt, která se pomalu štěpí, ale je odstraněna 95 % TFA. Tyto vlastnosti umožňují odstranění S-Mmt skupin zředěnou TFA na pevné fázi bez ztráty S-Dpm skupin. Volné sulfhydryly mohou být následně oxidovány za vzniku prvního disulfidického můstku. Následné ošetření koktejlem TFA/DMSO/anisol odštěpí peptid od pryskyřice, odstraní S-Dpm skupiny a v jednom kroku vytvoří druhý disulfidický můstek.

Cys(Acm) a Cys(tBu)

Pro přípravu cysteinylpeptidu lze také použít ochranu Acm a tBu. Tento přístup se však již obecně nepoužívá.

Acm a t-butylové skupiny jsou stabilní za podmínek potřebných pro odstranění všech ostatních ochranných skupin postranních řetězců. Proto je možné provést mezipřečištění peptidu před odštěpením těchto cysteinových ochranných skupin. Odstranění těchto ochranných skupin lze dosáhnout působením octanu rtuťnatého (II) nebo trifluormethanesulfonanu stříbrného. V druhém případě vede působení stříbrné soli cysteinylpeptidu s aq. HCl-DMSO k přímé tvorbě disulfidické vazby⁸.

UPOZORNĚNÍ: Rtuť a soli stříbra jsou toxické a žíravé; při používání těchto činidel je třeba dbát velké opatrnosti.  Je nutné používat vhodnou ochranu očí, laboratorní plášť a rukavice.  Dodržujte místní, státní/provinční a federální bezpečnostní předpisy. Používejte v účinné digestoři.

Metoda 1: Deprotekce peptidů chráněných Acm pomocí Hg(II)⁹

Pro pohodlí lze tyto reakce provádět v odstředivé zkumavce.

1. Rozpusťte (Acm) peptid v 10% aq. AcOH (5-10 mg/ml) a velmi opatrně upravte pH roztoku na 4,0 ledovým AcOH.
2. Přidejte octan rtuťnatý (II) (10 eq./Acm) a znovu upravte pH na 4,0 AcOH nebo aq. NH₃. Směs jemně promíchejte při pokojové teplotě pod přikrývkou N₂.
3. Přidejte β-merkaptoethanol (20 eq./Acm) a směs nechte 5 hodin stát.
4. Odstraňte sraženinu odstředěním a supernatant odsolte pomocí HPLC.

Metoda 2: Deprotekce t-butylem chráněných peptidů pomocí Hg(II)¹⁰

1. Rozpusťte (tBu) peptid v ledově chladném TFA (5-10 mg/ml).
2. K vzniklému roztoku přidejte octan rtuťnatý (II)/tBu (10 eq./tBu) a směs jemně míchejte při pokojové teplotě po dobu 3 hodin pod přikrývkou N₂.
3. Odstraňte TFA odpařením za sníženého tlaku při pokojové teplotě a zbytek znovu rozpusťte v 10% vodném roztoku kyseliny octové.
4. Přidejte β-merkaptoethanol (20 eq./tBu) a směs nechte 5 hodin stát.
5. Odstraňte sraženinu odstředěním a supernatant odsolte pomocí HPLC.

Metoda 3: Odstranění Acm skupiny pomocí Ag(I)¹¹

1. Rozpusťte (Acm) peptid v TFA/anisolu (99:1) (1 mg/ml).
2. K výslednému roztoku přidejte trifluormethanesulfonan stříbrný (100 eq./Acm) a poté míchejte při 4 °C po dobu 2 hodin.
3. Stříbrnou sůl peptidu srazte etherem a izolujte odstředěním.
4. Peptid ošetřete dithiotreitolem (DTT)(40 eq./Acm) v 1 M kyselině octové při 25 °C po dobu 3 hodin. Odstřeďte a supernatant odsolte pomocí HPLC.
5. Ošetřete peptid aq. 1M HCl/DMSO (1:1) přes noc při pokojové teplotě. Odstraňte AgCl filtrací a izolujte produkt pomocí HPLC.

Cys(t-butylthio) a Cys(STmp)

Vložení Cys(tButhio)¹² nebo Cys(STmp)¹³. zbytků do sekvence umožňuje selektivní deprotekci thiolové skupiny na pevné fázi, což umožňuje buď modifikaci zbytků Cys, nebo tvorbu disulfidového můstku na rezinu.

T-butylthio skupina je stabilní vůči TFA za předpokladu, že se thioly nepoužívají jako odlučovače při štěpné reakci. Odstraňuje se redukcí buď pomocí thiolů¹² nebo trialkylfosfinů^14,15. Nedávno Góngora-Benítez, a další ¹⁶ prokázali účinnost 20% β-merkaptoethanolu, 0.1 M NMM v DMF pro odstranění tbutylthia na pevné fázi, kde samotný β-merkaptoethanol nebo fosfiny byly neúspěšné.

V praxi se však často ukazuje, že je velmi obtížné odstranit tButhiovou skupinu na pevném nosiči. Z tohoto důvodu společnost Albericio nedávno zavedla skupinu STmp¹³. Zdá se, že skupina STmp se velmi snadno odstraňuje mírnou thiolýzou, neboť Albericio uvedl odstranění čtyř skupin STmp na pevné fázi pouhými třemi pětiminutovými ošetřeními 0.1 M N-methylmorfolinu (NMM) v DMF obsahujícím 5 % merkaptoethanolu.

Metoda 4: Odstranění STmp na pryskyřici pomocí thiolů

1. Ošetření peptidylové pryskyřice 5% β-merkaptoethanolem, O.1. NMM v DMF po dobu 5 minut při pokojové teplotě.
2. Pryskyřici promyjeme DMF a ošetření thioly opakujeme ještě dvakrát.

Cys(Mmt)

Deprotekci zbytků Cys(Mmt) na pryskyřici pomocí 2% TFA v DCM lze provádět dávkovým nebo kontinuálním průtokovým způsobem. V druhém případě lze reakci sledovat spektrofotometricky sledováním uvolňování tritylového kationtu při vlnové délce 460 nm. Při vsádkové syntéze lze do reakce přidat trityl scavenger, jako je TIS nebo TES, aby se zvýšilo štěpení. Barevná indikace, kterou poskytuje tritylkation, se však ztratí.

Reakce by se měla provádět v uzavřené nálevce ze slinutého skla, aby se zabránilo odpařování vysoce těkavého DCM, a filtrační reakce by se měla provádět za použití N₂ tlaku spíše než za použití vakua.

Metoda 5: Odstranění Mmt pomocí 2% TFA v DCM.

Dávková metoda:

1. Předem se suchá pryskyřice (1 g) rozmíchá s DCM v nálevce ze slinutého skla (typu s kohoutkem a zátkou). Odstraňte přebytečný DCM.
2. Přidejte 94:1:5 DCM/TFA/TIS (10 ml), nálevku uzavřete a 2 min. protřepávejte. Odstraňte rozpouštědlo použitím N₂ tlaku.
3. Pětkrát opakujte krok 2.
4. Pryskyřici promyjte DCM a vysušte ve vakuu.

Průtoková metoda:

1. Pryskyřice (1 g) se předem rozmíchá s DCM a zabalí se do reakční kolony.
2. Přes pryskyřici se čerpá 1% TFA v DCM (2 ml/min). Reakci lze sledovat měřením absorbance eluentu na koloně pomocí průtokové cely 0,1 mm při vlnové délce 460 nm^a.
3. Po ukončení reakce, jak je indikováno návratem absorbance na základní hodnotu, propláchněte kolonu DCM.
   ^aPokud peptid obsahuje jiné ochranné skupiny na bázi tritylu, hladina se nevrátí na výchozí hodnotu vzhledem k pomalému vyluhování skupin Trt.

V praxi může být obtížné dosáhnout úplného odstranění Mmt skupiny, zejména pokud se Mmt nachází směrem k Ckonci peptidu. Prodloužené ošetření 2% TFA může vést ke ztrátě ochranných skupin z postranních řetězců aminokyselin.

Nakládání se sulfhydrylovými peptidy

Sulfhydrylové peptidy jsou snadno oxidovány vzdušným kyslíkem, proto by měly být ihned po štěpení vysušeny mrazem a skladovány v suchu pod argonem. Aby se minimalizovala předčasná oxidace, mělo by se s peptidy obsahujícími cystein manipulovat v kyselých (0,1% TFA) odplyněných pufrech. Pro analýzu by měly být pufry HPLC rovněž odplyněny pomocí He spargingu. Peptidy obsahující více zbytků Cys mohou po štěpení vyžadovat redukci.

Tvorba disulfidové vazby oxidací cysteinylpeptidů

Náhodná oxidace sulfhydrylových peptidů

Nejjednodušší metodou tvorby jednoho nebo více disulfidických můstků je náhodná oxidace volného sulfhydrylového peptidu. V tomto případě peptidů obsahujících více než dva zbytky Cys se složení vzniklých produktů může lišit v závislosti na tom, zda je oxidace prováděna pod termodynamickou nebo kinetickou kontrolou.

Termodynamická kontrola

Z těchto technik je nejjednodušší provést oxidaci vzduchem, která poskytuje termodynamicky nejstabilnější produkt. Tento postup spočívá v jednoduchém vystavení vodného roztoku peptidu atmosféře v těkavém pufru a následné izolaci peptidu lyofilizací. Malé monocyklické peptidy lze snadno připravit provedením vzdušné oxidace bezprostředně po odštěpení Cys(Trt) pomocí TFA, aniž by bylo nutné přečistit meziprodukt sulfhydrylový peptid (metoda 6). Nevýhodou tohoto postupu je, že reakce mohou být někdy velmi pomalé. Bylo také prokázáno, že aktivní uhlí účinně katalyzuje tento proces¹⁷.

Metoda 6: Oxidace vzduchem

1. Rozpusťte cysteinylový peptid v 0.1 M deaerovaného hydrogenuhličitanu amonného (0,1-10 mg/ml).
2. Směs nechte stát otevřenou atmosféře, dokud není reakce dokončena. (Reakci lze sledovat buď pomocí HPLC, nebo Ellmanovým testem).
3. Izolujte produkt lyofilizací.

POZNÁMKA: Koncentrace lineárního peptidu může vyžadovat optimalizaci, aby se minimalizovala tvorba polymerů. Polymerní materiál lze odstranit odsolením na koloně Sephadex G-15.

Metoda 7: Oxidace glutathionu

1. Rozpusťte cysteinylový peptid v 0,5 ml vody.2 M deaerovaného fosfátového pufru, pH 7,5 (0,1 - 10 mg/ml) obsahujícího 1 mM EDTA, redukovaný (5 mM) a oxidovaný (0,5 mM) glutathion.
2. Míchejte směs po dobu 1 až 2 dnů a zároveň sledujte reakci pomocí HPLC.
3. Izolujte produkt lyofilizací a odsolte pomocí HPLC nebo GPC.

Oxidace směsí cysteinu a cystinu nebo redukovaného a oxidovaného glutathionu je vhodná pro oxidaci peptidů obsahujících více disulfidových můstků. Přítomnost přebytku redukované složky vede k pomalé přestavbě meziproduktů s disulfidovými můstky na termodynamicky nejstabilnější izomer.

Kinetická oxidace

Různé oxidanty byly použity pro rychlou tvorbu disulfidových můstků za vzniku kineticky nejvýhodnějšího produktu. Patří mezi ně ferrikyanid draselný¹⁸, jód¹⁹, DMSO^{20, 21}./sup>, N-chlorsukcinimid (NCS) ²² a DPDS (2,2'-dithiopyridin)²³.

Oxidace jodem je velmi rychlá a lze ji provést tak, že do rychle míchaného roztoku peptidu kápnete roztok jódu, dokud se roztok předem nezbarví do žluta.

Oxidace DMSO je velmi mírná a funguje při pH od 3 do 8. V případě, že se roztok jodu změní na žlutý, je možné ho použít jako oxidant. Nebyly zaznamenány žádné vedlejší reakce týkající se citlivých zbytků (Met, Trp, Tyr).

NCS v DMF byl použit pro oxidaci sulfhydrylů na pevné fázi, přičemž již 2 ekvivalenty ovlivnily oxidaci za 15 minut²². Toto činidlo může způsobit oxidaci methioninu.

Metoda 8: Jodová oxidace volných sulfhydrylových peptidů

1. Rozpusťte cysteinylový peptid (0,5 %) a nechte ho oxidovat.1 -10 mg/ml) v odplyněném AcOH/voda nebo MeOH/voda.
2. Přidávejte 0,06 M roztok jódu v MeOH po kapkách za rychlého míchání, dokud roztok nezíská mírně žluté zbarvení. Přebytek jódu se uhasí 1M kyselinou askorbovou.
3. Produkt se izoluje lyofilizací a odsolí se pomocí HPLC nebo GPC.

Metoda 9: Oxidace DMSO

1. Rozpusťte cysteinylpeptid v AcOH. Zřeďte vodou na (0,1 - 10 mg/ml.
2. Přidejte uhličitan amonný na pH 6 a následně DMSO (10 % obj.).
3. Míchejte směs po dobu 4- 24 h a zároveň sledujte reakci pomocí HPLC.
4. Izolujte produkt pomocí HPLC.

Metoda 10: DPDS oxidace²³

1. Rozpusťte cysteinylový peptid (0,1 - 10 mg/ml) v 0.1 M hydrogenuhličitanu amonného.
2. Přidejte 5 mM roztok DPDS v MeOH (3 eq.).
3. Míchejte směs po dobu 30 - 120 min za současného sledování reakce pomocí HPLC.
4. Okyselte TFA a izolujte produkt pomocí HPLC.

Metoda 11: Oxidace NCS na pryskyřici²²

1. Odstraňte Cys-STmp nebo Mtt skupiny na pevné fázi. Pryskyřici promyjte DMF.
2. Pryskyřici s peptidylem ošetřete NCS (2 eq.) v DMF po dobu 15 min. při rt.
3. Pryskyřici promyjte DMF a DCM. Odštěpte peptid z pryskyřice. Neměly by se používat thiolové čističe, protože tato činidla způsobí redukci disulfidové vazby. Ve většině případů lze EDT nahradit TIS

.

Tvorba disulfidové vazby oxidací chráněných cysteinylpeptidů

Tvorba disulfidické vazby oxidací jodem

Působení jodu na peptidy obsahující zbytky Cys(Acm)/Cys(Trt) vede k současnému odstranění sulfhydrylových ochranných skupin a k tvorbě disulfidické vazby. Peptidy obsahující jediný zbytek Cys se přemění na symetrický dimer, zatímco peptidy obsahující více zbytků se v závislosti na rozpouštědle a koncentraci přemění na směsi cyklického monomeru a polymeru. Rychlost reakce je velmi závislá na rozpouštědle, což umožňuje určitý stupeň selektivity mezi Cys(Trt) a Cys(Acm); v dipolárních rozpouštědlech, jako je např. aq. MeOH a aq. AcOH, reagují Cys(Trt) i Cys(Acm) rychle, zatímco v nepolárních rozpouštědlech, jako jsou DCM a CHCl₃, je oxidace Cys(Acm) velmi pomalá²⁴.

Nejčastějším použitím této metody je konverze peptidů s deprotekcí postranního řetězce, které obsahují dva zbytky Cys(Acm), na cyklický monomer s disulfidovým můstkem; použití tritylové ochrany není vhodné, protože tato skupina bude odstraněna během štěpení TFA. Reakce se obvykle provádí ve vysokém ředění ve směsích aq. MeOH nebo aq. AcOH, přičemž přesná volba rozpouštědla závisí na sekvenci. Reakce probíhají nejrychleji v aq. MeOH; ale pro peptidy obsahující Tyr, His a Trp je vhodné použít aq. Pro jódovou oxidaci chráněných peptidových fragmentů v roztoku se doporučuje, aby ze dvou zbytků Cys, které mají být spojeny disulfidickým můstkem, byl jeden chráněn Acm a druhý Trt. Toto opatření omezuje tvorbu polymerů a umožňuje použití nepolárních směsí rozpouštědel, jako je TFE/CHCl₃ které podporují rozpouštění chráněného fragmentu. Bylo zjištěno, že jodová oxidace peptidů obsahujících zbytek Cys s volnou N-aminovou funkcí probíhá velmi pomalu, což je pravděpodobně důsledek kladného náboje na aminoskupině, který brání tvorbě sulfonového meziproduktu.

Migrace Acm z cysteinu na postranní řetězce Gln^25a a Ser/Thr^25b zbytků byla zaznamenána během jodových a thalliových (III) oxidačních reakcí

Metoda 12: Obecná metoda jodové oxidace

1. Rozpusťte peptid Cys-Acm (15 µmol) v AcOH (30 ml). Zaslepte pod N₂.
2. Přidejte 160 mM aq. HCl (5 ml). Přidejte 20 mM I₂ v AcOH (45 mL).
3. Po 30-120 min intenzivního míchání (po vymizení výchozího materiálu) uhaste jód přidáním 1 M aq. thiosíranu sodného nebo kyseliny askorbové po kapkách, dokud směs nezíská bezbarvou barvu, a zkoncentrujte odpařením za sníženého tlaku na přibližně jednu třetinu původního objemu. Izolujte produkt pomocí HPLC.

Alternativně²⁶:

3. Po 30 -120 min intenzivního míchání přidejte 480 ml studeného diethyletheru. Chlaďte na suchém ledu po dobu 10 min. Izolujte peptid centrifugací.

Přebytečný jód lze také odstranit extrakcí roztoku CCl₄ nebo ošetřením aktivním uhlím nebo práškovým Zn.

Tvorba dvou disulfidů jedním hrncem (podle [27])

1. Rozpusťte peptid 2xCys, 2xCys-Acm v AcOH (2 mg/ml) pod přikrývkou N₂.
2. Přidejte cca 1 eq I₂ jako 0,5 M I₂ v MeOH po kapkách, dokud se neobjeví trvalé hnědé zbarvení. Přidejte dalších 9 eq jódu. Přidejte vodu, 20 % objemu použitého AcOH a směs promíchejte
3. Odstraňte přebytečný jód, jak je popsáno výše

Oxidace trifluoroacetátu thallia

Stejně jako jód, Tl(CF₃CO₂)₃ převádí peptidy obsahující více zbytků Cys(Acm) na odpovídající peptidy s disulfidovým můstkem cystinu [28]. V roztoku se tato reakce obvykle prováděla v TFA, protože to je vynikající rozpouštědlo pro volné i chráněné peptidy. Pro přímou tvorbu disulfidické vazby na pevné fázi byl jako rozpouštědlo použit DMF, který umožňuje dobré bobtnání pryskyřice bez předčasného štěpení peptidových řetězců. Je důležité poznamenat, že Met a Trp musí být při zpracování Tl(CF₃CO₂)₃ chráněny, aby se zabránilo oxidaci těchto citlivých zbytků; Met(O) a Trp(Mts), a Trp(Boc) byly použity ve spojení s t-Boc²⁸ a Fmoc^29,30 strategiemi.

UPOZORNĚNÍ: Soli thalia jsou vysoce toxické a žíravé; při používání těchto činidel je třeba dbát velké opatrnosti.  Je nutné používat vhodnou ochranu očí, laboratorní plášť a rukavice. Dodržujte místní, státní/provinční a federální bezpečnostní předpisy.  Používejte v účinné digestoři.

Metoda 13: Oxidace v roztokové fázi pomocí Tl(III)²⁸

1. Rozpusťte peptid v TFA (1-10 mg/ml) s anisolem (10 µl) a přidejte k němu roztoky TFA.L/mg) a ochlaďte v ledové lázni
2. Přidejte Tl(CF₃CO₂)₃ (1.2 eq.) a necháme reagovat 5-18 h.
3. Odstraníme TFA odpařením ve vakuu a peptid vysrážíme etherem. Odstřeďte a dekantujte éter a odstraňte přebytečné tálové činidlo.
4. Přidejte čerstvý éter, protřepejte zkumavku, aby se peptid rozptýlil, a odstřeďte. Dekantujte éter a třikrát zopakujte promývací proces.

Metoda 14: Oxidace na pevné fázi s Tl(III) ^{29, 30}

1. Suspendujte peptidylovou pryskyřici v DMF/anisolu (19:1) a přidejte Tl(CF₃CO₂)₃ (1.2 eq. vzhledem k peptidu)
2. Nechejte stát při 0 °C po dobu 80 min a promyjte pryskyřici DMF
3. Odstraňte peptid z pryskyřice pomocí TFA. Neměly by se používat thiolové čističe, protože tato činidla způsobí redukci disulfidové vazby. Ve většině případů lze EDT nahradit TIS.

Regioselektivní tvorba disulfidové vazby

Syntéza peptidů obsahujících více disulfidů selektivní tvorbou můstků není úkol, který by se měl provádět lehce. Při syntéze peptidů obsahujících vícenásobné disulfidové vazby se často dosahuje nejlepších výsledků náhodnou oxidací, protože požadovaný biologicky aktivní izomer je obecně termodynamicky nejstabilnější. Metody, které fungují pro jeden peptid, nemusí nutně fungovat pro jiný. Někdy lze bez problémů vytvořit dva můstky, ale vytvoření třetího se pak může ukázat jako obtížné. Kromě toho je často rozhodující pořadí, v jakém se můstky tvoří. Selektivní tvorba prvního můstku může poskytnout šablonu pro správnou tvorbu dalších můstků náhodnou oxidací.

Pro selektivní tvorbu dvou disulfidických vazeb lze použít kombinace ochrany Trt a Acm nebo STmp a Acm: první disulfidická vazba se vytvoří po selektivním odstranění ochrany Trt nebo STmp; tvorba druhé disulfidické vazby se pak provede v jediném kroku ošetřením peptidu chráněného Acm jódem nebo trifluoroacetátem thalia. Alternativně lze s Trt a Acm provést reakci v roztoku v jednom kroku, kdy se první disulfid vytvoří rychlou oxidací disulfhydrylového peptidu stechiometrickým množstvím jódu, po níž následuje přídavek přebytečného jódu a vody, aby došlo k oxidaci thiolů chráněných Acm (metoda 12).

Kombinace STmp a Mmt usnadňuje selektivní tvorbu dvou můstků na pevné fázi²². Skupiny STmp se odstraní ošetřením merkaptoenthanolem (metoda 4) a první můstek se vytvoří oxidací s NCS (Methd 11). Odstraněním Mmt pomocí 2% TFA v DCM (metoda 5) a následnou oxidací opět pomocí NCS se získá druhý můstek.

Tabulka 2 Kombinace ochranných skupin pro selektivní syntézu vícenásobných disulfidových vazeb.

První	Druhý	Třetí	Komentáře
Trt	Acm		1: přemostění oxidací na vzduchu nebo stechiometrickou oxidací I2. 2: nadměrnou oxidací I2.
tBu	MeBzl		Teplotně řízená oxidace s DMSO/TFA
Mmt		Tvorba obou můstků na pryskyřici s oxidací NCS
Mmt	Dpm		Tvorba jednoho můstku z pryskyřice. Druhý můstek vzniká v roztoku oxidací na vzduchu
STmp	Acm		1: Na pryskyřici s oxidací NCS. 2: s oxidací v pevné fázi nebo v roztoku I2.
STmp	Mmt	Acm	1 & 2: Tvorba obou můstků na pryskyřici s oxidací NCS. 3: Oxidace I2 v roztoku.
STmp	Mmt	tBu	1 & 2: Tvorba obou můstků na pryskyřici s oxidací NCS. 3: DMSO/TFA nebo MeSiCl3/Ph2SO v roztoku
Trt	tBu	1: přemostění oxidací na vzduchu nebo stechiometrickou oxidací I2. 2: nadbytečnou oxidací I2. 3: TFA/DMSO nebo MeSiCl3/Ph2SO.
Trt	tBu	MeBzl	1: přemostění oxidací na vzduchu nebo stechiometrickou oxidací I2. 2 & 3: teplotně řízenou oxidací pomocí TFA/DMSO

t-Butylová ochrana ve spojení s jednostupňovým štěpením a cyklizací pomocí MeSiCl₃/Ph₂SO, byla použita k zavedení třetího disulfidového můstku, což vedlo k selektivní syntéze -konotoxinu a inzulinu³¹. Podobným způsobem byla použita kombinace tBu a MeBzl ochrany cysteinu při regioselektivní jednopotové tvorbě dvou disulfidických vazeb -konotoxinu SI³². První disulfidická vazba byla vytvořena odštěpením tBu skupin a současnou oxidací pomocí TFA/DMSO/anisolu při pokojové teplotě. Následné zahřátí na 70 °C vedlo ke štěpení MeBzl skupin a vzniku druhého disulfidického můstku. Další příklady použití tohoto přístupu při syntéze vícemřížkových peptidů jsou uvedeny v referencích^33-36. Tyto metody mohou způsobit oxidaci Met a Trp zbytků.

Metoda 15: MeSiCl₃/Ph₂SO oxidace³¹

1. Rozpusťte peptid Cys-tBu v TFA (1 - 10 mg/ml)
2. Přidejte Ph₂SO (10 eq.), CH₃SiCl₃  (100-250 eq) a anisol (100 eq.)
3. Reakci nechte probíhat 10-30 min při 25 °C
4. reakci uhaste NH₄F (300 eq.) a peptid vysrážejte přidáním velkého objemu studeného diethyletheru a izolujte. centrifugací

Metoda 16: TFA/DMSO oxidace³²

1. Rozpusťte peptid v TFA/DMSO/anisolu (97.9/2/0,1) (2 mg/ml)
2. Míchejte při pokojové teplotě po dobu 40 min. Přidejte další alikvotní část TFA/DMSO/anisolu (40 mikroL/mg peptidu)
3. Při 70 °C zahřívejte po dobu 3 h. Precipitujte peptid diethyletherem a izolujte odstředěním.

Asymetrické disulfidy

S-Npysem chráněné peptidy rychle reagují s thioly v širokém rozsahu pH za vzniku smíšených disulfidů^.37, díky čemuž je tato ochranná skupina zvláště užitečná pro přípravu konjugátů peptid-protein nebo peptidů se dvěma různými řetězci spojenými disulfidickým můstkem^38-41. Avšak vzhledem k nestabilitě skupiny Npys vůči piperidinu při použití chemie Fmoc se zbytek Cys(Npys) obvykle zavádí na Nkonci peptidu pomocí Boc-Cys(Npys)-OH. Alternativně bylo zjištěno, že Npys skupinu lze přidat post-synteticky k jakémukoli Trt chráněnému Cys zbytku přidáním 5 ekvivalentů 2,2'-dithio-bis-(5-nitropyridinu) ke standardnímu TFA/TIS/voda (95:2.5:2,5) štěpné směsi⁴².

Přímé konverze Cys(tBu) na Cys(Pys) v přítomnosti Cys(Acm) a disulfidového můstku bylo dosaženo ošetřením DPDS/thioanisolem/TFA/TFMSA⁴³. Tato metoda byla použita k získání aktivovaného relaxinového řetězce A, klíčového meziproduktu pro syntézu inzulinu podobného hormonu relaxinu⁴³.

Metoda 17: konverze tBu na Pys⁴³

1. Rozpusťte peptid Cys-tBu a DPDS (4 eq.) v TFA a thioanisolu (9:1 v/v) (50 mg/ml).
2. Směs byla zchlazena na ledu, načež byl přidán podobný objem TFMSA v TFA (1:4 v/v) a reakce probíhala 45 min při 0 °C.
3. Precipitace Cys(Pys) peptidu studeným diethyletherem a izolace centrifugací. Peleta se 4x promyje čerstvým etherem, aby se odstranil přebytek DPDS.

Redukce disulfidických vazeb

Redukce pomocí DTT

DTT (kód výrobku 233153-M) se od svého zavedení W. W. Clelandem⁴⁴ stal standardním činidlem pro redukci cystinylpeptidů. Má malý zápach, je dobře rozpustný ve vodě a kvantitativně redukuje disulfidy ve vodném prostředí při pH 8.

Metoda 18: Redukce pomocí DTT

1. Rozpusťte peptid v 0,5 ml vody.1 M hydrogenuhličitanu amonného (1-3 mg/ml).
2. Přidejte DTT (5násobný přebytek vzhledem k thiolovým skupinám).
3. Směs se přelije N₂ a nechá se stát 6 h.
4. Směs se okyselí AcOH a lyofilizuje.
5. DTT se odstraní gelovou filtrací.

Redukce pomocí TCEP

TCEP je ve vodě rozpustný fosfin, který redukuje disulfidy v širokém rozsahu pH (1,5 -9,0)⁴⁵. Na rozdíl od redukčních činidel na bázi thiolů není TCEP citlivý na kyslík, takže není nutné provádět žádná zvláštní opatření k vyloučení přístupu vzduchu. Reakce je nevratná a kineticky řízená, na rozdíl od reakce s DTT, která je řízena termodynamicky⁴². Použití TCEP je ideální pro redukci peptidů, které nejsou rozpustné při pH 8 potřebném pro redukci pomocí DTT. Je třeba poznamenat, že delší kontakt peptidu s nadbytkem TCEP může způsobit desulfurizaci cysteinových zbytků.

Metoda 19: Redukce pomocí TCEP

1. Rozpusťte peptid v jakékoli vhodné směsi vodného/organického rozpouštědla (1-3 mg/ml, pH ).
2. Přidejte TCEP (5násobný přebytek vzhledem k disulfidu).
3. Mírně míchejte roztok po dobu 1 h.
4. Přečistěte redukovaný peptid pomocí HPLC nebo gelové filtrace.

Ellmanův test

5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoová kyselina) (DTNB) kvantitativně reaguje s alifatickými sulfhydrylovými skupinami za vzniku žlutého aniontu. Tuto reakci lze použít ke sledování průběhu oxidačních reakcí na vzduchu. Vzorky z reakční směsi se odebírají ve vhodných intervalech a testuje se obsah thiolů^{46, 47}.

Metoda 20: Ellmanova zkouška

1. Rozpusťte DTNB (40 mg) v 0,5 ml vody.1 M fosforečnanového pufru sodného, pH 8 (10 ml).
2. Odeberte vzorek z reakční směsi a zřeďte pufrem tak, abyste získali 3 ml roztoku obsahujícího 0,1-0,2 µmol peptidu. K roztoku peptidu se přidá činidlo DTNB (0,1 ml) a směs se nechá 15 min stát. Změřte absorbanci při vlnové délce 410 nm pomocí 1 cm cely.
3. Připravte referenční roztok přidáním činidla DTNB (0,1 ml) do pufru (3 ml) a změřte absorbanci.
4. Vypočítejte koncentraci sulfhydrylových skupin pomocí následující rovnice; [SH] = [A410(vzorek)-A410(referenční)]/13650.

Odkazy

Odkazy

1. Albericio F. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford: University Press.

2. Shabanpoor F. 2013. Peptide Synthesis & Applications Methods in Molecular Biology. 1047 , 81. Human Press.

3. Akcam M, Craik D. 2013. Peptide Synthesis & Applications Methods in Molecular Biology. 1047(89):

4. Kaiser T, Nicholson G, Kohlbau H, Voelter W. 1996. Racemization studies of Fmoc-Cys(Trt)-OH during stepwise Fmoc-Solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 37(8):1187-1190. https://doi.org/10.1016/0040-4039(95)02406-9

5. Han Y, Albericio F, Barany G. 1997. Occurrence and Minimization of Cysteine Racemization during Stepwise Solid-Phase Peptide Synthesis1,2. J. Org. Chem.. 62(13):4307-4312. https://doi.org/10.1021/jo9622744

6. Lukszo J, Patterson D, Albericio F, Kates SA. 1996. 3-(1-Piperidinyl)alanine formation during the preparation ofC-terminal cysteine peptides with the Fmoc/t-Bu strategy. Lett Pept Sci. 3(3):157-166. https://doi.org/10.1007/bf00132978

7. Giralt E, Andreu D, Atherton E. 1990. Peptides. Proc. 21st European Peptide Symposium; Leiden Escom: p. 243.

8. FUJIWARA Y, AKAJI K, KISO Y. 1994. Racemization-Free Synthesis of C-Terminal Cysteine-Peptide Using 2-Chlorotrityl Resin.. Chem. Pharm. Bull.. 42(3):724-726. https://doi.org/10.1248/cpb.42.724

9. Pearson D, Blanchette M, Guindon C. 1989. Tetrahedron Letters. 30,21. Great Britain: Pergamon Press plc.

10. Ramos-Tomillero I, Rodríguez H, Albericio F. 2015. Tetrahydropyranyl, a Nonaromatic Acid-Labile Cys Protecting Group for Fmoc Peptide Chemistry. Org. Lett.. 17(7):1680-1683. https://doi.org/10.1021/acs.orglett.5b00444

11. Góngora-Benítez M, Mendive-Tapia L, Ramos-Tomillero I, Breman AC, Tulla-Puche J, Albericio F. 2012. Acid-Labile Cys-Protecting Groups for the Fmoc/tBu Strategy: Filling the Gap. Org. Lett.. 14(21):5472-5475. https://doi.org/10.1021/ol302550p

12. TAMAMURA H, OTAKA A, NAKAMURA J, OKUBO K, KOIDE T, IKEDA K, IBLKA T, FUJII N. Disulfide bond-forming reaction using a dimethyl sulfoxide/aqueous HCl system and its application to regioselective two disulfide bond formation. 45(4):312-319. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1995.tb01043.x

13. Veber D, Milkowski J, Varga S, Denkewalter R, Hirschmann R. 1972. Acetamidomethyl. A Novel Thiol Protecting Group for Cysteine. J. Am. Chem. Soc.. 94(15):5456-5461. https://doi.org/10.1021/ja00770a600

14. NISHIMURA O, KITADA C, FUJINO M. 1978. New method for removing the S-p-methoxybenzyl and S-t-butyl groups of cysteine residues with mercuric trifluoroacetate.. Chem. Pharm. Bull.. 26(5):1576-1585. https://doi.org/10.1248/cpb.26.1576

15. Albericio F. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford University Press.

16. Postma TM, Giraud M, Albericio F. 2012. Trimethoxyphenylthio as a Highly Labile Replacement fortert-Butylthio Cysteine Protection in Fmoc Solid Phase Synthesis. Org. Lett.. 14(21):5468-5471. https://doi.org/10.1021/ol3025499

17. WEBER U, HARTTER P. 1970. S-Alkylmercapto-Gruppen zum Schutz der SH-Funktion des Cysteins, I. Synthese und Stabilität einigerS-(Alkylmercapto)cysteine. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 351(2):1384-1388. https://doi.org/10.1515/bchm2.1970.351.2.1384

18. Rüegg UT, Gattner H. 1975. Reduction of S-Sulpho Groups by Tributylphosphine: An Improved IVIethod for the Recombination of Insulin Chains. Hoppe-Seyler´s Zeitschrift für physiologische Chemie. 356(2):1527-1534. https://doi.org/10.1515/bchm2.1975.356.2.1527

19. BEEKMAN NJ, SCHAAPER WM, TESSER GI, DALSGAARD K, KAMSTRUP S, LANGEVELD JP, BOSHUIZEN RS, MELOEN RH. Synthetic peptide vaccines: palmitoylation of peptide antigens by a thioester bond increases immunogenicity. 50(5):357-364. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1997.tb01195.x

20. Góngora-Benítez M, Tulla-Puche J, Paradís-Bas M, Werbitzky O, Giraud M, Albericio F. 2011. Optimized Fmoc solid-phase synthesis of the cysteine-rich peptide linaclotide. Biopolymers. 96(1):69-80. https://doi.org/10.1002/bip.21480

21. 1998. Correspondence. Journal of Clinical Epidemiology. 51(4):365. https://doi.org/10.1016/s0895-4356(97)00299-0

22. McCurdy S. 1989. The investigation of Fmoc-cysteine derivatives in solid phase peptide synthesis. . Pept Res. . 2(1):147-152.

23. POHLS M, AMBROSIUS D, GRÖTZINGER J, KRETZSCHMAR T, SAUNDERS D, WOLLMER A, BRANDENBURG D, BITTER-SUERMANN D, HÖCKER H. Cyclic disulfide analogues of the complement component C3a Synthesis and conformational investigations. 41(4):362-375. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00452.x

24. Otaka A, Koide T, Shide A, Fujii N. 1991. Application of dimethylsulphoxide(DMSO) / trifluoroacetic acid(TFA) oxidation to the synthesis of cystine-containing peptide. Tetrahedron Letters. 32(9):1223-1226. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)92050-1

25. Tam JP, Wu CR, Liu W, Zhang JW. 1991. Disulfide bond formation in peptides by dimethyl sulfoxide. Scope and applications. J. Am. Chem. Soc.. 113(17):6657-6662. https://doi.org/10.1021/ja00017a044

26. Postma TM, Albericio F. 2013. N-Chlorosuccinimide, an Efficient Reagent for On-Resin Disulfide Formation in Solid-Phase Peptide Synthesis. Org. Lett.. 15(3):616-619. https://doi.org/10.1021/ol303428d

27. Maruyama K, Nagasawa H, Suzuki A. 1999. 2,2?-Bispyridyl disulfide rapidly induces intramolecular disulfide bonds in peptides. Peptides. 20(7):881-884. https://doi.org/10.1016/s0196-9781(99)00076-5

28. Kamber B, Hartmann A, Eisler K, Riniker B, Rink H, Sieber P, Rittel W. 1980. The Synthesis of Cystine Peptides by Iodine Oxidation ofS-Trityl-cysteine andS-Acetamidomethyl-cysteine Peptides. Helv. Chim. Acta. 63(4):899-915. https://doi.org/10.1002/hlca.19800630418

29. LAMTHANH H, ROUMESTAND C, DEPRUN C, MÉNEZ A. Side reaction during the deprotection of (S-acetamidomethyl)cysteine in a peptide with a high serine and threonine content. 41(1):85-95. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00118.x

30. Zhang S, Lin F, Hossain MA, Shabanpoor F, Tregear GW, Wade JD. 2008. Simultaneous Post-cysteine(S-Acm) Group Removal Quenching of Iodine and Isolation of Peptide by One Step Ether Precipitation. Int J Pept Res Ther. 14(4):301-305. https://doi.org/10.1007/s10989-008-9148-x

31. NA. NA.

32. FUJII N, OTAKA A, FUNAKOSHI S, BESSHO K, WATANABE T, AKAJI K, YAJIMA H. 1987. Studies on peptides. CLI. Syntheses of cystine-peptides by oxidation of s-protected cysteine-peptides with thallium(III) trifluoroacetate.. Chem. Pharm. Bull.. 35(6):2339-2347. https://doi.org/10.1248/cpb.35.2339

33. Munson MC, Barany G. 1993. Synthesis of .alpha.-conotoxin SI, a bicyclic tridecapeptide amide with two disulfide bridges: illustration of novel protection schemes and oxidation strategies. J. Am. Chem. Soc.. 115(22):10203-10210. https://doi.org/10.1021/ja00075a040

34. ALBERICIO F, HAMMER RP, GARCÍA-ECHEVERRÍA C, MOLINS MA, CHANG JL, MUNSON MC, PONS M, GIRALT E, BARANY G. Cyclization of disulfide-containing peptides in solid-phase synthesis?. 37(5):402-413. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb00755.x

35. Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y. 1993. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc.. 115(24):11384-11392. https://doi.org/10.1021/ja00077a043

36. Cuthbertson A, Indrevoll B. 2000. A method for the one-pot regioselective formation of the two disulfide bonds of ?-conotoxin SI. Tetrahedron Letters. 41(19):3661-3663. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)00437-8

37. Atherton E, Sheppard RC, Ward P. 1985. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2065. https://doi.org/10.1039/p19850002065

38. Yang Y, Sweeney WV, Schneider K, Chait BT, Tam JP. 1994. Two-step selective formation of three disulfide bridges in the synthesis of the C-terminal epidermal growth factor-like domain in human blood coagulation factor IX. Protein Sci.. 3(8):1267-1275. https://doi.org/10.1002/pro.5560030813

39. Akaji K, Fujino K, Tatsumi T, Kiso Y. 1993. Total synthesis of human insulin by regioselective disulfide formation using the silyl chloride-sulfoxide method. J. Am. Chem. Soc.. 115(24):11384-11392. https://doi.org/10.1021/ja00077a043

40. Zamborelli T. 2000. A comparison of folding techniques in the chemical synthesis of the epidermal growth factor?like domain in neu differentiation factor ?/?. Journal of Peptide Research. 55(5):359. https://doi.org/10.1034/j.1399-3011.2000.00672.x

41. Ihlenfeldt H. 1994. Peptides . Proc. 23rd European Peptide Symposium; Leiden ESCOM: p. 369.

42. Nielsen JS, Buczek P, Bulaj G. 2004. Cosolvent-assisted oxidative folding of a bicyclic?-conotoxin ImI. J. Peptide Sci.. 10(5):249-256. https://doi.org/10.1002/psc.531

43. Matsueda R, Aiba K. 1978. A STABLE PYRIDINESULFENYL HALIDE. Chem. Lett.. 7(9):951-952. https://doi.org/10.1246/cl.1978.951

44. DRIJFHOUT J, PERDIJK E, WEIJER W, BLOEMHOFF W. Controlled peptide-protein conjugation by means of 3-nitro-2-pyridinesulfenyl protection-activation. 32(3):161-166. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1988.tb00930.x

45. ALBERICIO F, ANDREU D, GIRALT E, NAVALPOTRO C, PEDROSO E, PONSATI B, RUE-GAYO M. Use of the Npys thiol protection in solid phase peptide synthesis Application to direct peptide-protein conjugation through cysteine residues. 34(2):124-128. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1989.tb01500.x

46. PLOUX O, CHASSAING G, MARQUET A. Cyclization of peptides on a solid support. Application to cyclic analogs of Substance P. 29(2):162-169. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1987.tb02242.x

47. SIMMONDS RG, TUPPER DE, HARRIS JR. Synthesis of disulfide-bridged fragments of ?-conotoxins GVIA and MVIIA. 43(4):363-366. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1994.tb00532.x

48. Ghosh AK, Fan E. 2000. A novel method for sequence independent incorporation of activated/protected cysteine in Fmoc solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 41(2):165-168. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(99)02045-6

49. Bathgate RAD, Lin F, Hanson NF, Otvos, L, Guidolin A, Giannakis C, Bastiras S, Layfield SL, Ferraro T, Ma S, et al. 2006. Relaxin-3:  Improved Synthesis Strategy and Demonstration of Its High-Affinity Interaction with the Relaxin Receptor LGR7 BothIn VitroandIn Vivo?. Biochemistry. 45(3):1043-1053. https://doi.org/10.1021/bi052233e

50. Cleland WW. 1964. Dithiothreitol, a New Protective Reagent for SH Groups*. Biochemistry. 3(4):480-482. https://doi.org/10.1021/bi00892a002

51. Burns JA, Butler JC, Moran J, Whitesides GM. 1991. Selective reduction of disulfides by tris(2-carboxyethyl)phosphine. J. Org. Chem.. 56(8):2648-2650. https://doi.org/10.1021/jo00008a014

52. Ellman GL. 1959. Tissue sulfhydryl groups. Archives of Biochemistry and Biophysics. 82(1):70-77. https://doi.org/10.1016/0003-9861(59)90090-6

53. Ellman GL, Courtney K, Andres V, Featherstone RM. 1961. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemical Pharmacology. 7(2):88-95. https://doi.org/10.1016/0006-2952(61)90145-9