Štěpení a deprotekce pryskyřice Fmoc

Obsah

• Příprava peptidové pryskyřice pro štěpení (metoda 1)
• Štěpení a deprotekce TFA (metoda 2-3)
• Obecné protokoly zahrnující silné kyseliny (metoda 4)
• Štěpení z velmi citlivých kyselinových pryskyřic (metoda 5-6)
• Peptidy připojené pomocí HMBA a oximového linkeru (metoda 7-11)

• Peptidy připojené pomocí sulfamylbutyrylových pryskyřic (metoda 12)
• Peptidy připojené pomocí hydrazinobenzoylových pryskyřic (metoda 13)
• Peptidy navázané na DBZ pryskyřici (Metoda 14)
• Aldehydy peptidů (Metoda 15-16)

Úvod

Po úspěšné syntéze chráněného peptidu je nutné současně oddělit peptid od pryskyřičného nosiče a odstranit všechny ochranné skupiny postranních řetězců aminokyselinových zbytků, aby se získal požadovaný peptid. V případě Fmoc SPPS se tento krok obvykle provádí ošetřením peptidylové pryskyřice TFA. Během tohoto procesu vznikají z ochranných skupin a úchytů na pryskyřici vysoce reaktivní kationty, které mohou, pokud nejsou zachyceny, reagovat s těmi zbytky, které obsahují nukleofilní funkční skupiny, a tím je modifikovat: Trp, Met, Tyr a Cys. Aby se tomu zabránilo, přidávají se do TFA různá nukleofilní činidla (tzv. scavengery), která tyto ionty zhášejí^{1, 2}

Prosazuje se mnoho univerzálních štěpných směsí, z nichž nejoblíbenější je Reagent K (TFA/voda/fenol/thioanisol/EDT [82].5:5:5:5:2.5])¹. Díky pokroku v technologii ochranných skupin a linkerů, zejména zavedení derivátů Fmoc-Trp(Boc) a Fmoc-Arg(Pmc/Pbf), však takovéto složité směsi obsahující toxická a zapáchající činidla již nejsou až na výjimečné případy nutné.

Většinu problémů lze zmírnit vhodnou volbou derivátu chráněné aminokyseliny a pryskyřice (Tabulka 1).  Pokud se dodrží tato doporučení, postačí pro většinu sekvencí použití TFA/TIS/voda (95:2,5:2,5).  Existují samozřejmě sekvence, zejména ty, které obsahují cystein a četné t-butylchráněné zbytky, pro které tato směs neposkytuje uspokojivé výsledky; v těchto případech se doporučuje přidat do směsi EDT nebo použít činidlo K. Nicméně jako obecný, nemalodózní štěpicí koktejl se tato směs ukázala jako pozoruhodně účinná.

Pro ty, kteří nechtějí použít doporučení uvedená v tabulce 1, bude při výběru nejvhodnější směsi nápomocen vývojový diagram uvedený na obrázku 1 

.

Deriváty aminokyseliny Fmoc
Arg(Pmc)/Arg(Pbf)
Asp(OtBu)/(OMpe)
Asn(Trt)
Cys(Acm)/Cys(Mmt)/Cys(tBu)/Cys(Trt)
Glu(OtBu)Gln(Trt)
His(Clt/)His(Trt)
Lys(Boc)/Lys(ivDde)/Lys(Mmt)
Ser(tBu)/Ser(Trt)
Thr(tBu)/Thr(Trt)
Tyr(tBu)/Tyr(2-ClTrt)
Trp(Boc)

Tabulka 1: Doporučená ochranná skupina a strategie pryskyřice.

Pryskyřice
Wangova, HMPA a Rinkova amidová a 2-chlorotritylchloridová pryskyřice pro C-koncové Cys, Met, Trp, Tyr

Odstranění N-koncové Fmoc skupiny

Před provedením kyselého štěpení peptidylové pryskyřice je třeba odstranit N-koncovou Fmoc skupinu pomocí piperidinu. Ověřte si to v návodu k použití vašeho syntetizéru; mnoho syntetizérů automaticky naprogramuje odstranění N-koncové Fmoc-skupiny jako poslední krok syntézy.

Příprava peptidové pryskyřice na štěpení

Peptidová pryskyřice by měla být důkladně promyta, zejména pokud se při syntéze používá DMF, protože je netěkavý a zbytky bazického DMF mohou mít výrazný inhibiční účinek na TFA-acidolýzu. U nosičů na bázi PEG a polyakrylamidu je žádoucí promytí mírně kyselým činidlem, jako je kyselina octová, která nezpůsobí uvolnění peptidu, protože tyto typy pryskyřic mají tendenci se držet DMF³. Před štěpením je třeba provést důkladné promytí a vysušení (Metoda 1).

Poznámka: Kyselina octová by neměla být použita k promytí extrémně kyselých pryskyřic kyseliny Rink, TGT nebo 2-chlorotritylu.

Metoda 1: Příprava peptidové pryskyřice ke štěpení

1. Pevtidovou pryskyřici vložte do nálevky ze slinutého skla a trochu ji odsajte.
2. Několikrát promyjte DMF, kyselinou octovou a poté DCM. Dále promyjte MeOH (polystyren) nebo etherem (polyakrylamid), aby se pryskyřice smrštila.
3. Peptidovou pryskyřici vyjměte a sušte 4 h ve vysokém vakuu nebo nejlépe o/n nad KOH.

Štěpení a deprotekce TFA

Optimální podmínky štěpení velmi závisí na jednotlivých přítomných aminokyselinových zbytcích, jejich počtu a sekvenci, ochranných skupinách postranních řetězců a typu linkeru připojeného k pryskyřici.

Vzhledem k variabilitě chování různých peptidových pryskyřic se doporučuje provést předběžné štěpení peptidové pryskyřice v malém měřítku s použitím 20-50 mg vzorku, aby se určily optimální podmínky štěpení, například volba scavengeru (scavengerů) a délka reakce.

To umožní stanovit rozsah štěpení (např. kvantitativní analýzou referenční aminokyseliny připojené k linkeru, je-li to vhodné) a kvalitu surového štěpeného peptidu (pomocí HPLC a analýzy aminokyselin). U většiny peptidů lze za předpokladu dodržení doporučení uvedených v tabulce 1  ovlivnit štěpení pomocí TFA/TIS/voda (95:2,5:2,5).  V případech, kdy se vyskytnou problémy, poskytne uspokojivé řešení použití činidla K nebo přidání EDT do výše uvedené směsi.

V případě Rink Amidové pryskyřice je fenylbenzyletherová vazba, která spojuje rukojeť s pryskyřicí, citlivá na kyseliny a může být porušena, zejména pokud je uvolňování produktu během štěpné reakce pomalé, což vede ke vzniku barevných vedlejších produktů, které se z produktu nesnadno odstraňují jednoduchým promytím. Tomu lze předejít použitím dvoukrokového postupu popsaného v Metodě 3 nebo lépe použitím silanových odlučovačů. Tyto kroky nejsou nutné u pryskyřic obsahujících stabilnější modifikované linkery Rink, jako jsou pryskyřice Rink Amide AM, Rink Amide MBHA a NovaSyn^® TGR.

Methionin, cystein a tryptofan jsou extrémně náchylné k alkylaci kationty vznikajícími během procesu štěpení. Reakce tryptofanu, methioninu nebo cysteinu s t-butylovými kationty vede k modifikaci produktového peptidu; reakce s linkerovým kationtem vede k nevratnému opětovnému připojení peptidu k pryskyřici³. S methioninem může dojít k další reakci, která vede ke vzniku homoserinu a fragmentaci peptidového řetězce. Přidáním scavengerů do štěpné směsi lze tyto vedlejší reakce do značné míry potlačit. Jednou z výjimek je sulfonace tryptofanu produkty vznikajícími při štěpení Mtr, Pmc a Pbf chráněných argininových zbytků⁴. Tuto vedlejší reakci lze naštěstí eliminovat použitím Fmoc-Trp(Boc)^5-8. Tento derivát také potlačuje opětovné navázání Ckoncových zbytků Trp na kationt vzniklý na linkeru pryskyřice. Bylo také prokázáno, že ochranné skupiny na bázi sulfonylu jsou spojeny s tvorbou Nsulfonovaného Arg⁹ a O-sulfonovaných Ser a Thr¹⁰.

Nejčastěji používaným úklidovým prostředkem je EDT. Nejenže je mimořádně dobrým scavengerem pro t-butylové kationty, ale pomáhá při odstraňování tritylové ochranné skupiny z cysteinu a je obzvláště účinný při prevenci kyselinou katalyzované oxidace tryptofanových zbytků.

Potlačení kyselinou katalyzované oxidace Met lze provést zařazením ethylmethyl sulfidu (EMS), EDT nebo thioanisolu do směsi čisticích prostředků; ačkoli tvorbu methioninsulfoxidu lze minimalizovat provedením štěpné reakce pod dusíkem, zajištěním, aby se pro srážení produktu používal pouze éter bez peroxidu a aby se všechna rozpouštědla před použitím důkladně odplynila. Je také známo, že thioanisol urychluje odstranění Arg(Mtr/Pmc/Pbf) v TFA; při použití tohoto činidla je však vhodné postupovat opatrně, protože existují důkazy, že může způsobit částečné odstranění Acm, tButhio nebo tBu ochranných skupin ze zbytků Cys¹¹.

Obrázek 1: Vývojový diagram pro výběr štěpného koktejlu pro Fmoc SPPS

Předpokládá se, že fenol poskytuje určitou ochranu zbytkům Tyr a Trp¹. Bylo prokázáno, že trialkylsilany, jako jsou TIS a TES, jsou účinnými, nepáchnoucími náhradami EDT¹², zejména pro peptidy obsahující Arg(Pmc) a Trp(Boc)^{5, 8}. Tato činidla jsou také velmi účinná při zhášení vysoce stabilizovaných kationtů uvolněných při štěpení Trt ¹², Tmob^13, a Rink Amid linkeru, a proto se jejich použití v případě přítomnosti těchto částí důrazně doporučuje.

Pokud je v peptidu přítomno několik méně kyselinotvorných ochranných skupin nebo pokud je peptid dlouhý, a obsahuje tedy mnoho ochranných skupin, je obvykle třeba dobu štěpení výrazně prodloužit. Skupina Mtr je méně acidolabilní než skupiny PMC nebo Pbf a její úplné odstranění může trvat až 24 hodin. V takových případech, kdy je Trp přítomen s několika ochrannými skupinami Mtr, je velmi užitečné mít možnost optimalizovat podmínky štěpení sledováním odstranění této ochranné skupiny pomocí HPLC. Je třeba najít kompromis mezi částečně tryptofanem modifikovaným peptidem a neúplnou deprotekcí Arg(Mtr). Proto se u peptidů obsahujících Trp důrazně doporučuje používat Trp(Boc)-deriváty, aby se zabránilo modifikaci postranního řetězce tryptofanu.

U dlouhých peptidů může být nutné použít prodlouženou dobu štěpení, aby se zcela odstranila ochrana všech postranních řetězců. Pokud se úplné deprotekce nedosáhne do 6 hodin, měl by se peptid vysrážet éterem a štěpení opakovat s čerstvými činidly. Měly by se provést testovací štěpení, aby se zjistil optimální režim štěpení. Neúplná deprotekce postranních řetězců je často přehlížena jako příčina neúspěchu při syntéze dlouhých peptidů.

Problémy byly pozorovány u pomalé deprotekce Nkoncových zbytků Asn(Trt). Ty lze snadno překonat prodloužením doby štěpení na 4 hodiny nebo použitím Asn(Dmcp) místo Asn(Trt).

Metoda 2: Obecné štěpení TFA

UPOZORNĚNÍ: TFA je extrémně žíravá kapalina, při použití tohoto činidla je třeba dbát velké opatrnosti. Správná ochrana očí, laboratorní plášť a rukavice jsou povinné. Dodržujte místní, státní/provinční a federální bezpečnostní předpisy. Používejte v účinném digestoři.

1. Vložte suchou pryskyřici do baňky a přidejte roztok TFA obsahující vhodné čisticí prostředky (10-25 ml/g pryskyřice, obrázek 1). POZNÁMKA: měl by být proveden výpočet, aby se zajistilo dostatečné množství scavengeru pro kvalitu přítomného peptidu a ochranných skupin. Baňka se zazátkuje a nechá se stát při rt za občasného promíchání. Doba reakce závisí na pořadí (viz "Sledování štěpné reakce" níže).
2. Pryskyřici odstraňte filtrací za sníženého tlaku. Pryskyřici dvakrát promyjte TFA. Spojte filtráty a přidejte (po kapkách) 8-10násobný objem studeného etheru. Někdy je nutné odpařit většinu TFA, aby se dosáhlo dobrého vysrážení surového peptidu. Eter lze ochladit ledem, aby se ještě více napomohlo vysrážení.
3. Izolujte peptid podle popisu v Metodě 17.

Metoda 3: Dvoustupňový postup pro odštěpení/deprotekci Rink amidové pryskyřice

1. Pryskyřici rozmělníme v 10% TFA v DCM a nalijeme ji do skleněné nálevky s jemným sintrem.
2. Nechte rozpouštědlo pomalu prosakovat vrstvou pryskyřice. Pryskyřici promyjte 5% TFA a nechte ji pomalu projít vrstvou pryskyřice. Odtržení je rovnováha katalyzovaná kyselinou, proto je důležité touto průtokovou metodou průběžně odstraňovat odtržený peptid. Prováděním reakce v baňce se nedosáhne úplného odštěpení. Výtěžnost lze zlepšit přidáním 1-5 % TIS do odštěpovací směsi.
3. Odstraňte přebytečnou TFA/DCM za sníženého tlaku a dokončete deprotekci pomocí 95 % TFA plus scavengerů podle složení aminokyselin (viz obrázek 1).

Monitorování reakce štěpení

Přítomnost Mtr chráněného argininu v peptidu vyžaduje prodloužení reakční doby, která se pohybuje od 3 do 6 hodin v závislosti na volbě použitých scavengerů (obrázek 1). Více argininových zbytků může vyžadovat prodloužení reakčních časů až na 24 hodin. V takových případech je velmi užitečné mít možnost optimalizovat podmínky štěpení sledováním odstranění této ochranné skupiny pomocí HPLC.

Obecné protokoly zahrnující silné kyseliny

Jako alternativu k TFA lze pro rychlou deprotekci méně kyselinově labilních ochranných skupin postranních řetězců, jako jsou Arg(Mtr/Pmc/Pbf), Asn(Mbh) a Gln(Mbh), použít silnější kyseliny s vhodnými scavengery bez hlášení vedlejších reakcí.

Štěpení peptidů pomocí trimethylsilylbromidu¹⁴

Dlouhé doby štěpení, které jsou často nezbytné pro úplnou deprotekci peptidů obsahujících více zbytků Arg(Mtr), mohou vést k vážnému zhoršení kvality produktu. Zejména delší vystavení peptidů obsahujících tryptofan působení EDT v TFA může vést k modifikaci tryptofanových zbytků v důsledku tvorby dithioketalu. Štěpení pomocí trimethylsilylbromidu (TMSBr) tyto problémy odstraňuje, protože bylo prokázáno, že toto činidlo čistě deprotekuje až 4 zbytky Arg(Mtr) za 15 minut. Kromě toho bylo zjištěno, že tato metoda zcela potlačuje tvorbu vedlejších sulfonovacích produktů, a to i v případě použití nechráněného tryptofanu¹⁵.

Metoda 4: Štěpení pomocí TMSBr

1. Přidejte TMSBr (1.32 ml) k roztoku EDT (0,50 ml), m-kresolu (0,1 ml) a thioanisolu (1,17 ml) v TFA (7,5 ml) ochlazeného na 0 °C. Přidejte peptidovou pryskyřici (200 mg) a směs nechte 15 min stát pod přikrývkou N₂ při 0 °C.
2. Pryskyřici odstraňte filtrací za sníženého tlaku. Pryskyřici dvakrát promyjte čistou TFA. Spojte filtráty a přidejte (po kapkách) 8-10násobný objem studeného etheru. Někdy je nutné odpařit většinu TFA, aby se dosáhlo dobrého vysrážení surového peptidu. Eter může být ochlazen ledem, aby se ještě více usnadnilo vysrážení.
3. Izolujte peptid podle popisu v Metodě 17.

POZNÁMKA: Občas je nutné dodatečné ošetření peptidu fluoridem amonným, aby se zvrátila případná silylace.

Štěpení z pryskyřic citlivých na velmi kyselé látky

Pryskyřice Rink Acid¹⁶, 2-chlorotrityl¹⁷, HMPB<.sup>18, NovaSyn TGT^19, a Sieberovy pryskyřice²⁰ obsahují vysoce citlivé kyselé linkery a jsou vhodné pro syntézu chráněných peptidů.

Pryskyřice HMPB &; Sieberovy amidové pryskyřice

Plně chráněné peptidové kyseliny lze generovat z HMPB linkeru²¹ a chráněné amidy ze Sieberovy amidové pryskyřice²⁰. Má-li se však zabránit předčasné ztrátě ochranných skupin postranních řetězců, je nutné provádět pečlivé experimenty. Nejlepší výsledky poskytne opakované ošetření peptidové pryskyřice roztokem 1% roztoku TFA v dichlormethanu spolu s minimálními reakčními časy.

V ideálním případě by se štěpení mělo provádět v uzavíratelné nálevce ze slinutého skla, aby se zabránilo odpařování vysoce těkavého DCM, a filtrace by se měla provádět za použití tlaku dusíku, nikoli za použití vakua.

Pokud peptid obsahuje Met nebo Trp, měl by se do štěpné směsi přidat 1% EDT, aby se zabránilo opětovnému navázání peptidu. Pokud peptid obsahuje C-koncový zbytek Trp, důrazně se doporučuje použití Trp(Boc)²¹.

Při tomto dávkovém postupu se síla kyseliny zvyšuje postupně, což je dáno množstvím přítomných pufrovacích skupin TFA. Maximální koncentrace peptidu může být obsažena v prvním nebo v jednom z pozdějších promývání v závislosti na pufrovací kapacitě amidových vazeb a dalších přítomných funkčních skupin. Ochranné skupiny postranních řetězců typu t-butylu, jakož i Trt (na Asn a Gln) zůstávají během tohoto procesu zcela neporušené²¹.

Metoda 5: Štěpení zředěnou TFA

1. Předem rozpusťte suchou pryskyřici (1 g) s DCM v uzavíratelné nálevce ze slinutého skla a odstraňte přebytečný DCM.
2. Přidejte 1% TFA v suchém DCM (10 ml), nálevku uzavřete a 2 min protřepávejte. Roztok přefiltrujte tlakem dusíku do baňky obsahující 10% pyridin v methanolu (2 ml).
3. Krok 2 opakujte až 10krát, zbytky chráněného peptidu z pryskyřice promyjte 3 x 30 ml DCM, 3 x 30 ml MeOH, 2 x 30 ml DCM, 3 x 30 ml MeOH a filtráty zkontrolujte pomocí TLC nebo HPLC.
4. Spojte filtráty, které obsahují produkt, a odpařte je za sníženého tlaku na 5 % objemu. Ke zbytku přidejte vodu (40 ml) a směs ochlaďte ledem, abyste napomohli vysrážení produktu.
5. Izolujte produkt filtrací přes nálevku ze slinutého skla. Produkt třikrát promyjte čerstvou vodou. Vzorek vysušte v exsikátoru ve vakuu nad KOH a později nad P₂O₅.

2-Chlorotrityl, NovaSyn^® TGT a NovaPEG Trt pryskyřice

2-Chlorotrityl¹⁷, NovaSyn^® TGT¹⁹ a NovaPEG Trt pryskyřice lze štěpit pomocí 1% TFA, jak je popsáno výše, nebo za mírnějších podmínek pomocí AcOH nebo TFE ²² za vzniku chráněných peptidů. Při přípravě chráněných peptidů se pro zavedení histidinu doporučuje zejména použití Fmoc-His(Clt)-OH. Tím se zabrání částečné deprotekci postranního řetězce histidinu, ke které může dojít při použití His(Trt).

Metoda 6: Štěpení pomocí TFE/DCM

1.   Ošetřete peptidylovou pryskyřici při rt s TFE/DCM (2:8) po dobu 3 x1 h.

2.   Po uplynutí příslušné doby odstraňte pryskyřici filtrací, 3x promyjte štěpící směsí.

3.   Odpařte roztok do sucha a vysrážejte chráněný peptid etherem.

Oddělený, plně chráněný peptid bude velmi hydrofobní a může být nutné jej dále extrahovat z pryskyřice pomocí DMF, DMSO. Úplnost odštěpení lze zkontrolovat pomocí TLC filtrátů. Přečistěte nízkotlakou chromatografií na silikagelu, HPLC na fenylkřemelině nebo rekrystalizací.

Peptidy připojené linkerem HMBA a oximem

Pro syntézu peptidových karboxamidů byl linker HMBA z velké části nahrazen linkery typu Rink Amide. Přesto je tento linker stále jedním z nejflexibilnějších linkerů peptidových pryskyřic. Peptidy lze z linkeru uvolnit pomocí mnoha různých nukleofilů a získat tak peptidy s různými funkčními skupinami na C-konci^{3, 22 -25}  (Tabulka 2). Tyto protokoly jsou rovněž kompatibilní s oximovým linkerem používaným v Boc SPPS.

Tabulka 2: Produkty štěpení HMBA linkeru.

Reagent	Produkt
NH3/MeOH	Karboxamid peptidu; Metoda 7
NH2NH2	Peptidhydrazid; Metoda 8
aq.NaOH	Kyselina peptidová; Metoda 9
MeOH/DIPEA	Methylester peptidů; Metoda 10
NaBH4/EtOH	Peptidový alkohol; Metoda 11

Metoda 7: Metanolové štěpení amoniakem za vzniku peptidových amidů^{3, 23}

1. Vložte suchou pryskyřici do baňky a přidejte 95% vodný roztok TFA (20 ml/g). Baňku zazátkujte a nechte stát při rt 1 h za občasného promíchání.
2. Pryskyřici izolujte filtrací za sníženého tlaku a promyjte TFA. Filtrát zlikvidujte. Pryskyřici promyjte DCM, 10% DIPEA v DCM, DCM.  Pryskyřici vysušte ve vakuu nad P₂O₅ o/n.
3. Vysušenou pryskyřici vložte do čisté, suché tlakové nádoby a dostatečného množství DMF k nabobtnání pryskyřice, následovaného roztokem suchého methanolu nasyceného amoniakem při 0 °C (20 ml/g)
4. Banku uzavřete a nechte zahřát na teplotu rt. Nechte stát 18 h a poté baňku opět ochlaďte na 0 °C. Opatrně otevřete ochlazenou nádobu a filtrujte pryskyřici přes sintrovanou skleněnou nálevku.
5. Pryskyřici nejprve promyjte methanolem a poté TFA do samostatné baňky, aby se odstranil veškerý peptid nerozpustný v methanolu.
6. Filtráty odděleně odpařte do sucha na rotační odparce. Srážejte peptid etherem a izolujte jej filtrací.

Poznámka: Pokud se peptidová pryskyřice před tímto postupem štěpení důkladně nevysuší, může se jako vedlejší produkt získat peptidová kyselina.

Metoda 8: Kleavace hydrazinem za vzniku C-koncového hydrazidu²⁴

Pokud je to nutné, měly by se nejprve odstranit ochranné skupiny postranních řetězců podle Metody 7, kroky  1 & 2.

1. Suspendujte peptidovou pryskyřici v DMF a přidejte 5% roztok hydrazinhydrátu v DMF (20 ml/g). Nechte stát 1 h při rt.
2. Pryskyřici přefiltrujte přes nálevku ze slinutého skla a promyjte ji nejprve DMF a poté TFA do samostatné baňky, aby se odstranil veškerý peptid nerozpustný v DMF.
3. Filtráty odděleně odpařte do sucha na rotační odparce. Sraďte peptid etherem a izolujte jej filtrací.

Metoda 9: Cleavage pomocí alkálií za vzniku volné kyseliny³

Ochranné skupiny postranních řetězců by měly být nejprve odstraněny pomocí Metody 7 kroků 1 & 2. V případě, že se jedná o volnou kyselinu, je třeba provést její odstranění.

1. Pryskyřice se předem zchladí v dioxanu.
2. 0,1 M NaOH/dioxan (1:3, 20 ml/g) se ochladí na 0 °C v ledové/vodní lázni. Přidejte peptidovou pryskyřici a nechte ji 15 min stát při rt.
3. Pryskyřici přefiltrujte pomocí skleněné sintrované nálevky do baňky obsahující 0,1 M HCl (5 ml/g). Tato baňka by měla být chlazena v ledové lázni, aby se zabránilo zahřívání, protože se neutralizuje bazický roztok.
4. Pryskyřici promyjte vodou a upravte pH filtrátu na 7,0. Filtrát lyofilizujte a chlorid sodný odstraňte gelovou filtrací.

Metoda 10: Cleavage s methanolem/DIPEA za vzniku methylesteru²⁴

Ochranné skupiny postranních řetězců by měly být nejprve odstraněny pomocí Metody 7, kroky 1 & 2. V případě, že se jedná o methylester, je třeba provést jeho odstranění.

1. Pryskyřici vložte do čisté baňky a přidejte dostatečné množství DMF, aby pryskyřice nabobtnala. Cleave o/n s DIPEA/MeOH/DMF (1:5:5, 50 ml/g).
2. Pryskyřici nejprve promyjte MeOH/DMF a poté TFA do samostatné baňky, aby se odstranil veškerý peptid nerozpustný v methanolu.
3. Filtráty odděleně odpařte do sucha na rotační odparce. Sraďte peptid etherem a izolujte jej filtrací.

Pokud jsou výtěžky nízké, opakujte reakci s čerstvými činidly při 50 °C.

Metoda 11: Kleavace borohydridem za vzniku peptidového alkoholu²⁵

Tato metoda je použitelná pouze pro pryskyřice typu TG a PEGA.

Ochranné skupiny postranních řetězců by měly být nejprve odstraněny pomocí Metody 7, kroky 1 & 2.

1. Peptidilovou pryskyřici (1,0 g) ošetřete 50% aq. etohem a nechte odkapat. Přidejte NaBH₄ (126 mg) ve 3 ml 50% aq. EtOH a jemně míchejte po dobu 4 h.
2. Pryskyřici odstraňte filtrací a promyjte 50% aq. EtOH (40 ml), abyste získali roztok peptidu o pH~9.

Před odštěpením peptidu z HMBA derivatizovaných pryskyřic je důležité, aby byly odstraněny ochranné skupiny postranních řetězců, zejména pokud peptid obsahuje Asp nebo Glu. Toho se dosáhne ošetřením peptidové pryskyřice 95% aq. TFA. Pokud peptid obsahuje Arg(Mtr), je nejlépe zbytek Arg deprotegovat po odštěpení peptidu z pryskyřice v dalším kroku ošetřením činidlem K.

Peptidy navázané sulfamylbutyrylovými pryskyřicemi, za vzniku thioesterů

Vytěsnění peptidového fragmentu thiolem z alkylované sulfamylbutyrylové pryskyřice poprvé popsali Pessi a spolupracovníci²⁶ a později další^{27 - 29} (obrázek 2). Po sestavení řetězce se pryskyřice aktivuje alkylací sulfonamidového dusíku, obvyklým ošetřením jodoacetonitrilem nebo TMS-CHN₂ Aktivace jodoacetonitrilem vytváří reaktivnější meziprodukt, zatímco u TMS-CHN₂ je vlastní proces aktivace účinnější. Metody aktivace byly přezkoumány v ref.³⁰. Vzniklý N-alkyl-N-acylsulfonamid se poté štěpí působením benzylmerkaptanu²⁶ nebo ethylmerkaptopropionátu /thiofenolu²⁷. Jako optimální se však jeví kombinace aktivace pomocí TMS-CHN₂ a vytěsnění ethylmerkaptopropionátem/thiofenolem
(Metoda 12). Ukázalo se, že použití 2M LiBr v THF jako štěpného rozpouštědla vede k výrazně lepším výtěžkům peptidového thioesteru³¹.

Výsledný chráněný peptidový thioester se poté ošetří TFA a příslušnými scavengery, čímž se získá deprotekovaný peptid připravený k ligaci.

Obrázek 2: Syntéza thioesterů pomocí sulfamylbutyrylových pryskyřic

Metoda 12: Tioesterová ligace pomocí sulfamylových pryskyřic

Aktivace acylsulfamylových pryskyřic

1. Předem rozpustit pryskyřici (0.1 mmole) v suchém THF v 10 ml polypropylenové stříkačce opatřené 20 mm polyethylenovým filtrem.
2. Přidejte 5 ml 1 M TMS-CHN₂ v suchém hexanu/THF (1:1).  Uzavřete stříkačku.
3. Agitujte opatrně po dobu 2 h.  Promyjte pryskyřici THF a ihned použijte, nebo promyjte THF, poté DCM a vysušte ve vakuu.

Odstraňování thioesteru

1. Před použitím methylovanou pryskyřici předem rozpusťte v DMF na 1 h.
2. Přidejte ethyl-3-merkaptopropionát (50 eq.) a thiofenoxid sodný (0,5 eq.), uzavřete stříkačku a směs jemně míchejte po dobu 24 h.
3. Pryskyřici odstraňte filtrací a třikrát ji promyjte DMF.
4. Spojte filtráty a odpařte je do sucha na rotační odparce.  Produkt se vytrituruje éterem.
5. Zbytek se ošetří TFA/voda/TIS/fenol (88:5:2:5) po dobu 2 h při rt.
6. Přidejte štěpný roztok po kapkách do 10 objemů etheru a izolujte produkt filtrací nebo odstředěním standardními metodami.  Produkt přečistěte pomocí RP-HPLC.

Ligace nechráněných peptidových fragmentů

1. Rozpusťte peptidový thioester (1 eq.) a N-terminální-Cys peptid (1 eq.) ve zkumavce se šroubovacím uzávěrem obsahující odplyněný 0,1 M fosforečnanový pufr sodný, pH 7,8. Rozpusťte peptidový thioester (1 eq.) a N-terminální-Cys peptid (1 eq.). V případě potřeby může roztok obsahovat také guanidin-hydrochlorid (až 6 M), aby se přidalo rozpouštění peptidových složek.  Konečná koncentrace peptidů by měla být 2-5 mM.
2. Přidejte thiofenol (1 % objemové z celkového roztoku), propláchněte dusíkem, znovu uzavřete zkumavku a směs silně promíchejte. Průběh reakce lze sledovat pomocí HPLC. Reakce obvykle končí za 5-16 h.
3. Reakci okyselte TFA (0,1 % objemového roztoku), lyofilizujte a přečistěte standardními postupy.

Peptidy navázané hydrazinobenzoylovými pryskyřicemi

Aryldiazeny, které vznikají oxidací arylhydrazinů, se za mírných podmínek snadno rozkládají za vzniku arenů a dusíkatých³². Tento proces využili Millington, et al.³³ jako základ nového linkeru s bezpečnostním záchytem, N-Fmoc-4-hydrazinobenzoové kyseliny (obrázek 3), který se dodává připojený k pryskyřici NovaGel™.

Metoda 13: Oxidační štěpení hydrazinobenzoylových pryskyřic

Pro získání amidů pomocí oxidace Cu(II)^.33

1. Suspendujeme pryskyřici v čistém aminu
2. Přidáme Cu(OAc)₂ (0.5 eq.) a intenzivně probublávejte vzduch přes pryskyřici po dobu 4 h.
3. Pryskyřici odstraňte filtrací a promyjte ji DCM.
4. Spojené organické filtráty odpařte do sucha. Znovu se rozpustí v DCM a promyje se 1 M KHSO₄, vodou a sat. NaCl.
5. Organickou vrstvu vysušte nad Na₂SO₄ a odpařte do sucha.

K získání esteru nebo aminu pomocí NBS³⁴

1. Pryskyřici rozpusťte v suchém DCM
2. Přidejte NBS (2 eq) a suchý pyridin (2 eq). Jemně míchejte po dobu 5 min.
3. Pryskyřici odstraňte filtrací a promyjte ji suchým DCM a suchým THF.
4. Pryskyřici znovu rozpusťte v suchém DCM a přidejte alkohol nebo amin (5 eq.) a jemně míchejte po dobu 4 h.
5. Pryskyřici odstraňte filtrací a promyjte DCM.
6. Spojené filtráty odpařte do sucha.

Obrázek 3: Aplikace Fmoc-4-hydrazinobenzoylových pryskyřic.

Po odstranění skupiny Fmoc lze hydrazinovou skupinu vázanou na pryskyřici snadno acylovat pomocí standardních spojovacích metod. Nosič je stabilní vůči piperidinu a TFA, což usnadňuje syntézu chráněných i nechráněných peptidových fragmentů.

Kleavace může být provedena za mírných oxidačních podmínek působením vzduchu a vhodného nukleofilu v přítomnosti octanu měďnatého (II) a pyridinu (nebo DBU) za vzniku produktů obsahujících řadu karboxylových modifikací, jako jsou kyseliny, estery a amidy.  V případech, kdy nukleofilní složka špatně rozpouští pryskyřici, mělo by být do reakční směsi zahrnuto ko-rozpouštědlo, jako je THF nebo DMF.

Alternativně lze reakci provést ve dvou fázích tak, že se nejprve vytvoří diazen oxidací pomocí NBS a poté se po odstranění přebytku oxidačního činidla provede štěpení nukleofilem. Výhodou této metody je, že se zamezí kontaminaci produktu mědí. Při syntéze esterů primárních a sekundárních alkoholů Peters & Waldmann³⁴ zjistil, že aktivace NBS dává nejvyšší výtěžek. Camarero a spolupracovníci použili tuto metodu také k přípravě peptidových p-nitroanilidů³⁵ a peptidových thioesterů ³⁶ za použití p-nitroanilinu a thioesterů aminokyselin jako nukleofilů.

Tato pryskyřice byla také použita k přípravě cyklických peptidů prostřednictvím strategie cyklického štěpení zahrnující intramolekulární útok N-koncové aminoskupiny na diazen³⁷.

Použití Fmoc-hydrazinobenzoylových pryskyřic bylo nedávno přezkoumáno.³⁸

Peptidy navázané na Dbz pryskyřici

Dbz pryskyřice poskytují pohodlný přístup k peptidovým thioesterům a thioesterovým náhražkám pomocí Fmoc SPPS^{39, 40}  (viz obrázek 4).

Před štěpením je nutné převést Dbz část na aktivovaný Nbz podle Metody 14. Reakce je obvykle kvantitativní. U vysoce zatížených pryskyřic, jako jsou Dawsonovy Dbz AM pryskyřice, může dojít k určitému zesíťování Dbz částí. Podle našich zkušeností se mnohem čistších výsledků dosahuje s pryskyřicemi s nízkým zatížením, jako je pryskyřice Dawson Dbz NovaSyn^® TGR. Ošetřením Nbz pryskyřice TFA se uvolní plně deprotekovaný peptid-Nbz, který lze použít přímo v reakci NCL. Peptid Nbz se získá jako směs regioizomerů.

Obrázek 4: Syntéza peptidových thioesterů pomocí Dbz pryskyřic.

Metoda 14: Tioesterová ligace s pryskyřicí Dawson Dbz AM

Syntéza & Aktivace

1. Prodlužte peptidový řetězec pomocí aktivace HBTU/HOBt/DIPEA, s výjimkou Gly, který by měl být zaveden pomocí Fmoc-Gly-OPfp/HOBt. N-koncový zbytek musí být zaveden pomocí Boc-aminokyseliny. Pryskyřice se promyje DMF a DCM.
2. Přidá se p-nitrofenylchloroformiát (0,5 mmole) v DCM a nechá se jemně míchat pod N2 po dobu 1 h. Pryskyřice se promyje DCM a přidá se 0,5 M DIPEA v DMF (10 ml) a nechá se působit 30 min. Pryskyřici promyjte DMF a DCM.
3. Pryskyřici promyjte TFA/vodou/TIS 95:2,5:2,5 po dobu 3 h.

Ligace nechráněných peptidových fragmentů

1. Rozpusťte přečištěný peptid-Nbz (1 eq.) a N-terminální peptid-Cys (1,5 eq.) do zkumavky se šroubovacím uzávěrem obsahující odplyněný ligační pufr (0,2 M fosfátový pufr, 6 M guanidin-hydrochlorid, 0,2 M kyselina 4-merkaptofenyloctová, 0,02M TCEP, pH 7,0). Konečná koncentrace peptidů by měla být přibližně 2 mM.
2. Sledujte průběh reakce pomocí HPLC.
3. Okyselte reakci pomocí TFA (0,1 % objemu roztoku), lyofilizujte a přečistěte standardními postupy.

Peptidové aldehydy

Existují tři základní přístupy k jejich přípravě: Za prvé, oxidace vhodného peptidového alkoholu⁴¹; za druhé, redukce derivátu peptidové karboxylové kyseliny, jako je Weinrebův ester^{42, 43}.(viz Metoda 15); konečně, postupná syntéza nebo syntéza fragmentů pomocí maskovaného předem vytvořeného aldehydu⁴⁴ (viz Metoda 16).

Peptidy navázané na Weinrebovu pryskyřici

Redukce N-methoxy-N-.methylamidů (Weinrebových amidů) s LiAlH₄ nebo DIBAL je osvědčenou strategií pro výrobu peptidů a a-aminoaldehydů⁴². Fehrentz a spolupracovníci⁴³ tuto metodiku upravili pro použití v SPOS, a to pomocí jednoduchého zařízení, kterým je nahrazení N-methylové skupiny Weinrebova amidu linkerem, který umožňuje připojení methoxyaminu k pevnému nosiči.

Vzhledem k brzdné povaze sekundárního aminu vázaného na pryskyřici je třeba pro přidání prvního zbytku použít HOAt/DIPCDI nebo HATU/DIPEA (Metoda 4). Výsledný nosič je stabilní vůči podmínkám Fmoc a Boc SPPS. Po redukci pomocí LiAlH₄ Fehrentz, et al. uvedli získání peptidových aldehydů ve výtěžcích 30-40 %.

Metoda 15: Redukční štěpení Weinrebových amidů

Aby se předešlo vedlejším reakcím s některými funkcemi postranních řetězců aminokyselin, obvykle se doporučuje ponechat všechny ochranné skupiny na místě; výjimkou je případ, kdy peptid obsahuje Asp a Glu, protože i t-Bu estery těchto zbytků se redukují LiAlH₄. U peptidů by měla být N-koncová aminoskupina blokována skupinou Boc; skupina Fmoc není za těchto podmínek stabilní.

1. Před použitím se pryskyřice (0,1 mmole) po dobu 1 h předem uchovává v suchém THF v baňce s kulatým dnem vybavené magnetickým míchadlem.
2. Baňku propláchněte argonem, poté ji uzavřete a umístěte do ledové lázně.
3. Pomocí injekční stříkačky přidejte 1 M LiAlH₄ v THF (0,5 ml, 0,5 mmole^a). Opatrně míchejte po dobu 40 min.
4. Směs zřeďte THF a přidejte nasycený KHSO₄ (0,5 ml) a K, Na vinan (0,3 ml). Směs jemně míchejte po dobu 30 min a nechte zahřát na rt.
5. Pryskyřici odstraňte filtrací a promyjte ji DCM.
6. Spojené organické filtráty vysušte bezvodým MgSO₄ a odpařte do sucha.

^aU dlouhých peptidů může být nutné zvýšit množství LiAlH₄; naopak u malých organických molekul lze toto množství značně snížit.

Metoda 16: Odštěpení H-Thr-Gly-NovaSyn® TG pryskyřice

Odštěpení od pryskyřice a deprotekce postranních řetězců se provádí ve dvou fázích.

1. Odstranění ochranných skupin postranních řetězců pomocí bezvodého TFA.
   
2. Odstranění peptidového aldehydu z pryskyřice pomocí AcOH/voda/DCM/MeOH (10:5:63:21) (3 x 30 min).

V současné době nabízí produktová řada Novabiochem^® pryskyřici H-Thr-Gly-NovaSyn^® TG předem naplněnou aldehydy Arg, Asp, Leu, Phe a Val.

Post-cleavage work-up

NEDOPORUČUJTE VYHazovat pryskyřičný nosič nebo éter, dokud není analýza peptidů dokončena. Obojí lze skladovat pod dusíkem nebo argonem při 4 °C, aby se zabránilo oxidaci.

Srážení etheru

Většina protokolů štěpení zahrnuje srážení surového rozštěpeného peptidu pomocí studeného etheru. Následují obecné postupy pro zpracování po štěpení.

Metoda 17: Pracovní postup po štěpení

Izolaci a pracovní postup s peptidem lze provést buď srážením (1), nebo odstřeďováním (2). Pro peptidy rozpustné ve vodě lze použít metodu uvedenou v krocích 3-6.

1. Precipitace: Sražený peptid přefiltrujte přes ztvrdlý filtrační papír v Hirschově nálevce za mírného vakua. Sraženina se dále promyje studeným etherem, peptid se rozpustí ve vhodném vodném pufru a lyofilizuje.
2. Centrifugace: Ke zbytku se přidá malý objem t-butylmethyletheru a důkladně se trituruje, dokud se nezíská volná suspenze. Suspenzi přeneste do čisté centrifugační zkumavky, uzavřete a odstřeďte. Je nezbytné, aby se pro tento proces používala odstředivka bez jisker. Opatrně dekantujte éter ze zkumavky. Promývání etherem podle potřeby opakujte. Zbytek pevné látky rozpusťte ve vhodném vodném pufru a lyofilizujte.
3. Vodou rozpustné peptidy: Po vysrážení přidejte ke zbytku vodu a přeneste směs do dělící nálevky. Může být nutné přidat trochu AcOH na podporu rozpouštění.
4. Nálevku se zátkou dobře protřepejte. Uvolněte zátku a nechte obě vrstvy oddělit postavením. Izolujte spodní (vodnou) vrstvu.
5. Dodejte do nálevky další vodu a krok 4 třikrát opakujte. Odstraňte horní (éterickou) vrstvu a uložte ji do čisté baňky. Vraťte spojené vodné extrakty do dělící nálevky.
6. Přidejte malé množství čerstvého diethyletheru a dvakrát nebo třikrát opakujte krok 4, přičemž pokaždé odstraňte etherickou vrstvu a vraťte vodnou vrstvu do dělící nálevky. Vodná vrstva se shromáždí v čisté baňce a lyofilizuje.

Ve výše popsaných metodách lze často zvýšit výtěžek peptidu, pokud se TFA nejprve odstraní pomocí rotační odparky (vybavené studeným prstem CO₂/aceton, olejovou pumpou a kyselinovou pastí) před krokem srážení éteru. Ve většině případů po přidání etheru peptid ulpí na stěnách reakční baňky, což umožní rychlé a snadné odstranění odlučovačů opakovaným promytím etherem. Poznámka: štěpné směsi obsahující TFMSA a HBF₄ by se neměly odpařovat do sucha.

Protože peptidy připravené metodou štěpení s nízkým a vysokým obsahem HF mohou obsahovat ve vodě rozpustné deriváty sulfonia, doporučuje se je odstranit bezprostředně před lyofilizací, protože za neutrálních nebo mírně bazických podmínek mohou způsobit alkylaci methioninových a cysteinových zbytků.

Odkazy

1. KING DS, FIELDS CG, FIELDS GB. A cleavage method which minimizes side reactions following Fmoc solid phase peptide synthesis. 36(3):255-266. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1990.tb00976.x

2. Albericio F, Kneib-Cordonier N, Biancalana S, Gera L, Masada RI, Hudson D, Barany G. 1990. Preparation and application of the 5-(4-(9-fluorenylmethyloxycarbonyl)aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)-valeric acid (PAL) handle for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides under mild conditions. J. Org. Chem.. 55(12):3730-3743. https://doi.org/10.1021/jo00299a011

3. Atherton E, Sheppard CR. 1989. Solid phase peptide synthesis: a practical approach. IRL Press, Oxford:

4. Sieber P, Riniker B. 1987. Protection of histidine in peptide synthesis: A Reassessment of the trityl group. Tetrahedron Letters. 28(48):6031-6034. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96856-4

5. Rivier EJ, Marshall RG. Peptides, Chemistry, Structure & Biology, Proc. 11th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp 950:

6. Smith AJ, Rivier EJ. 1992. Peptides, Chemistry, Structure & Biology, Proc. 12th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 537:

7. White P. 1991. Novabiochem Satellite Meeting. Solid Phase Synthesis, 2nd International Meeting; Canterbury

8. CHOI H, ALDRICH J. Comparison of methods for the Fmoc solid-phase synthesis and cleavage of a peptide containing both tryptophan and arginine. 42(1):58-63. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1993.tb00350.x

9. Roger E. 1994. Innovations & Perspectives in Solid Phase Synthesis. 3rd International Symposium; Birmingham pp. 251.: Mayflower Worldwide Ltd.

10. Fields CG, Fields GB. 1993. Minimization of tryptophan alkylation following 9-fluorenylmethoxycarbonyl solid-phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 34(42):6661-6664. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)61669-6

11. BECK-SICKINGER AG, SCHNORRENBERG G, METZGER J, JUNG G. Sulfonation of arginine residues as side reaction in Fmoc-peptide synthesis. 38(1):25-31. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1991.tb01405.x

12. JAEGER E, REMMER HA, JUNG G, METZGER J, OBERTHÜR W, RÜCKNAGEL KP, SCHÄFER W, SONNENBICHLER J, ZETL I. 1993. Nebenreaktionen bei Peptidsynthesen, V. O-Sulfonierung von Serin und Threonin während der Abspaltung der Pmc- und Mtr-Schutzgruppen von Argininresten bei Fmoc-Festphasen-Synthesen. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 374(1-6):349-362. https://doi.org/10.1515/bchm3.1993.374.1-6.349

13. Atherton E, Sheppard RC, Ward P. 1985. Peptide synthesis. Part 7. Solid-phase synthesis of conotoxin G1. J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.2065. https://doi.org/10.1039/p19850002065

14. Pearson DA, Blanchette M, Baker ML, Guindon CA. 1989. Trialkylsilanes as scavengers for the trifluoroacetic acid deblocking of protecting groups in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 30(21):2739-2742. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99113-5

15. Sole NA, Barany G. 1992. Optimization of solid-phase synthesis of [Ala8]-dynorphin A. J. Org. Chem.. 57(20):5399-5403. https://doi.org/10.1021/jo00046a022

16. Guol L, FUNAKOSHI S, FUJII N, YAJIMA H. 1988. Studies on peptides. CLXV. Combination of a new amide-precursor reagent and trimethylsilyl bromide deprotection for the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl-based solid-phase synthesis of chicken antral peptide.. Chem. Pharm. Bull.. 36(12):4989-4992. https://doi.org/10.1248/cpb.36.4989

17. Available from: https://www.febs.org/

18. Rink H. 1987. Solid-phase synthesis of protected peptide fragments using a trialkoxy-diphenyl-methylester resin.. Tetrahedron Letters. 28(33):3787-3790. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96384-6

19. Giralt E, Andreu D. 1991. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 419:

20. Barlos K, Gatos D, Kallitsis J, Papaphotiu G, Sotiriu P, Wenqing Y, Schäfer W. 1989. Darstellung geschützter peptid-fragmente unter einsatz substituierter triphenylmethyl-harze. Tetrahedron Letters. 30(30):3943-3946. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99290-6

21. Barlos K, Gatos D, Kapolos S, Papaphotiu G, Schäfer W, Wenqing Y. 1989. Veresterung von partiell geschützten peptid-fragmenten mit harzen. Einsatz von 2-chlortritylchlorid zur synthese von Leu15 -gastrin I. Tetrahedron Letters. 30(30):3947-3950. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)99291-8

22. Barlos K, et al. a. 1991. 2-cholorotrityl chloride resin. Int J Peptide Protein Res. 37513-520.

23. Girald E, Andreu D. 1991. Peptides 1990, Proc. 21st European Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 131:

24. Hodges SR, Smith AJ. 1994. Peptides, Chemistry, Structure & Biology. Proc. 13th American Peptide Symposium; ESCOM, Leiden pp. 157:

25. Sieber P. 1987. A new acid-labile anchor group for the solid-phase synthesis of C-terminal peptide amides by the Fmoc method.. Tetrahedron Letters. 28(19):2107-2110. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)96055-6

26. Smith AJ, Rivie EJ. 1992. Peptides, Chemistry & Biology, Proc. 12th American Peptide Symposium. ESCOM, Leiden pp. 525:

27. Chan W, White P. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. 222. Oxford University Press, Oxford: pp. 218.

28. Stewart MJ, Young DJ. 1984. Solid phase peptide synthesis. 2nd edition. Pierce Chemical Company, Rockford: pp. 91.

29. Mellor S, et a. 2000. Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach. Oxford University Press, Oxford: pp. 147-148.

30. Ingenito R, Bianchi E, Fattori D, Pessi A. 1999. Solid Phase Synthesis of Peptide C-Terminal Thioesters by Fmoc/t-Bu Chemistry. J. Am. Chem. Soc.. 121(49):11369-11374. https://doi.org/10.1021/ja992668n

31. Shin Y, Winans KA, Backes BJ, Kent SBH, Ellman JA, Bertozzi CR. 1999. Fmoc-Based Synthesis of Peptide-?Thioesters:  Application to the Total Chemical Synthesis of a Glycoprotein by Native Chemical Ligation. J. Am. Chem. Soc.. 121(50):11684-11689. https://doi.org/10.1021/ja992881j

32. Biancalana S, et. a. 2001. Fmoc chemistry compatible thio-ligation assembly of proteins. Lett Pept Sci. 7291-297.

33. Escher SE, Klüver E, Adermann K. 2001. 8(6):349-357. https://doi.org/10.1023/a:1016286204570

34. Heidler P, Link A. 2005. N-Acyl-N-alkyl-sulfonamide anchors derived from Kenner?s safety-catch linker: powerful tools in bioorganic and medicinal chemistry. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 13(3):585-599. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2004.10.045

35. Quaderer R, Hilvert D. 2001. Improved Synthesis of C-Terminal Peptide Thioesters on ?Safety-Catch? Resins Using LiBr/THF. Org. Lett.. 3(20):3181-3184. https://doi.org/10.1021/ol016492h

36. Patai S. 1975. The Chemistry of the hydrazo, azo and azoxy group Part 1. pp. 542: John Wiley & Sons, Ltd, Chichester.

37. Millington CR, Quarrell R, Lowe G. 1998. Aryl hydrazides as linkers for solid phase synthesis which are cleavable under mild oxidative conditions. Tetrahedron Letters. 39(39):7201-7204. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(98)01543-3

38. Peters C, Waldmann H. 2003. Solid-Phase Synthesis of Peptide Esters Employing the Hydrazide Linker. J. Org. Chem.. 68(15):6053-6055. https://doi.org/10.1021/jo034164k

39. Kwon Y, Welsh K, Mitchell AR, Camarero JA. 2004. Preparation of Peptidep-Nitroanilides Using an Aryl Hydrazine Resin. Org. Lett.. 6(21):3801-3804. https://doi.org/10.1021/ol048417n

40. Camarero JA, Hackel BJ, de Yoreo JJ, Mitchell AR. 2004. Fmoc-Based Synthesis of Peptide ?-Thioesters Using an Aryl Hydrazine Support?. J. Org. Chem.. 69(12):4145-4151. https://doi.org/10.1021/jo040140h

41. Rosenbaum C, Waldmann H. 2001. Solid phase synthesis of cyclic peptides by oxidative cyclative cleavage of an aryl hydrazide linker?synthesis of stylostatin 1. Tetrahedron Letters. 42(33):5677-5680. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)01075-9

42. Woo Y, Mitchell AR, Camarero JA. 2007. The Use of Aryl Hydrazide Linkers for the Solid Phase Synthesis of Chemically Modified Peptides. Int J Pept Res Ther. 13(1-2):181-190. https://doi.org/10.1007/s10989-006-9064-x

43. Blanco-Canosa J, Dawson P. 2008. An Efficient Fmoc-SPPS Approach for the Generation of Thioester Peptide Precursors for Use in Native Chemical Ligation. Angew. Chem. Int. Ed.. 47(36):6851-6855. https://doi.org/10.1002/anie.200705471

44. Harpaz Z, Siman P, Kumar KSA, Brik A. Protein Synthesis Assisted by Native Chemical Ligation at Leucine. Chem. Eur. J. of Chem. Bio.. 11(9):1232-1235. https://doi.org/10.1002/cbic.201000168

45. Pentelute BL, Barker AP, Janowiak BE, Kent SBH, Collier RJ. 2010. A Semisynthesis Platform for Investigating Structure?Function Relationships in the N-Terminal Domain of the Anthrax Lethal Factor. ACS Chem. Biol.. 5(4):359-364. https://doi.org/10.1021/cb100003r

46. Tiefenbrunn TK, Blanco-Canosa J, Dawson PE. Alternative chemistries for the synthesis of thrombospondin-1 type 1 repeats. Biopolymers. 94(4):405-413. https://doi.org/10.1002/bip.21486

47. Woo J, Sigeizumi S, Yamaguchi K, Sugimoto K, Kobori T, Tsuji T, Kondo K. 1995. Peptidyl aldehyde derivatives as potent and selective inhibitors of cathepsin L. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 5(14):1501-1504. https://doi.org/10.1016/0960-894x(95)00236-m

48. Nahm S, Weinreb SM. 1981. N-methoxy-n-methylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Letters. 22(39):3815-3818. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(01)91316-4

49. Fehrentz J, Paris M, Heitz A, Velek J, Liu C, Winternitz F, Martinez J. 1995. Improved solid phase synthesis of C-terminal peptide aldehydes. Tetrahedron Letters. 36(43):7871-7874. https://doi.org/10.1016/0040-4039(95)01646-y

50. 2000. N. J. Ede, et al. J. Pept. Sci., 6, 11.. https://doi.org/10.1002/(SICI)1099-1387(200001)6:1<11::AID-PSC229>3.0.CO;2-%23