Překonání agregace při syntéze peptidů na pevné fázi

• Sekundární náhražky aminokyselin
• Pseudoprolinové dipeptidy
• Protokoly pro použití pseudoprolinových dipeptidů
• DMB dipeptidy
• DMB/HMB aminokyseliny
• Deprotection
• Solubilizace agregovaných sekvencí

Trojrozměrná struktura, a tedy i biologická aktivita jednotlivých proteinů je do značné míry určena primární sekvencí aminokyselin, které jsou jejich součástí. Tato inherentní tendence peptidových řetězců vytvářet uspořádané struktury je hlavní příčinou vysoce sekvenčně specifické variability syntetické účinnosti, s níž se setkáváme při sestavování peptidů. Jak se peptid prodlužuje, může vytvářet sekundární struktury, které způsobují agregaci peptidového řetězce, což vede k nižší rychlosti reakce. Účinky se mohou pohybovat od nepatrného zpomalení až po úplné selhání deprotekčních i acylačních reakcí. V takových extrémních případech se peptid stává fakticky nerozpustným a není již k dispozici pro reakci.

Nástup závažné agregace při dávkové syntéze je obecně indikován zmenšením matrice pryskyřice, zatímco při kontinuální průtokové syntéze je detekován zploštěním a rozšířením profilu deprotekce. Za takových okolností obvyklé testy spojování s ninhydrinem nebo TNBS často přestávají být spolehlivé a mohou poskytovat falešně negativní výsledky.

Snadnost sestavení dané sekvence je obecně těžko předvídatelná a je jedním z faktorů, které činí syntézu peptidů zajímavou a náročnou. Peptidy obsahující úseky sousedících hydrofobních aminokyselin, jako jsou Ala, Val, Ile, a také ty, které obsahují aminokyseliny, jež mohou vytvářet vodíkové vazby uvnitř řetězce, jako jsou Gln, Ser a Thr, jsou často obtížně sestavitelné. Z tohoto důvodu je obecně lepší přijmout od počátku syntetické strategie, které zmírňují účinky tvorby struktury, než se snažit odhadnout, které peptidy mohou být problematické, a ztrácet čas a prostředky opakováním neúspěšných syntéz. U peptidových sekvencí delších než 20 aminokyselin se proto důrazně doporučuje sledovat sestavení peptidu pomocí malých štěpení TFA.

Většina přístupů vyvinutých ke zmírnění tohoto problému se snaží zlepšit solvataci komplexu peptid-resin. Patří mezi ně použití dipolárních aprotických rozpouštědel, jako je DMF, DMSO nebo NMP, chaotopických solí, speciálních koktejlů rozpouštědel, jako je "Magic Mixture"., nebo polárních pryskyřic na bázi PEG, jako je NovaSyn^® TG, NovaPEG nebo PEGA (Tabulka 1). Klíčovou roli může hrát také stupeň zesíťování polystyrenové pryskyřice s DVB, který by neměl být vyšší než 1 %, jinak může dojít k inhibici správného bobtnání. Dalším důležitým faktorem je funkcionalizace pryskyřice, přičemž pryskyřice s vysokým zatížením zhoršují účinky agregace, a právě z tohoto důvodu nabízí produktová řada Novabiochem^® speciální verze nejoblíbenějších nosičů používaných pro Fmoc SPPS s nízkým zatížením. Volba ochranné skupiny postranního řetězce může rovněž ovlivnit solvataci peptidů. Substituce Ser(tBu) nebo Thr(tBu) deriváty Trt, nebo Lys(Boc) deriváty Lys(Tfa) může mít příznivý účinek. Nicméně nejuniverzálnějším způsobem, jak zlepšit syntetickou účinnost, je reverzibilní ochrana amidové páteře klíčových zbytků zavedením sekundárních aminokyselinových náhražek

Pro podrobnou diskusi o tom, jak identifikovat a překonat účinky agregace, je čtenář odkázán na vynikající článek Quibella & Johnsona.¹⁰

Tabulka 1: Překonávání obtížných sekvencí.

Pryskyřice Pro dávkovou syntézu používejte pryskyřice s dobrými bobtnacími vlastnostmi, jako je řada NovaPEG, PEGA a NovaSyn® TG, a pryskyřice s nízkou substitucí.

Rozpouštědla Místo DCM používejte DMF, DMA, NMP nebo 25% DMSO v DMF.

Čas Použijte delší dobu spojování a/nebo dvojité spojování.

Chaotropní soli Před spojováním promyjte pryskyřici roztoky chaotropních solí, jako je 0,8 M NaClO4 nebo LiCl nebo 4 M KSCN v DMF nebo je přidejte do spojovací směsi.

Spojovací činidla Použijte různé aktivační metody, například PyBOP.®, PyBOP®/HOBt, HBTU, TBTU, PyBroP® a HATU a umožněte delší reakční časy.

Chraňte peptidovou vazbu pomocí sekundárních aminokyselinových náhražek Zařaďte Dmb nebo Hmb chráněný derivát nebo pseudoprolinový dipeptid pro každý šestý zbytek, je-li to možné.

"Magická směs" Použijte směs DCM/DMF/NMP (1:1:1) s 1% Tritonem X100 a 2 M ethylenkarbonátem při 55 °C jako rozpouštědlový systém pro acylaci a 20% piperidin v DCM/DMF/NMP (1:1:1) s 1% Tritonem X100 pro Fmoc-cleavage.

Sekundární náhražky aminokyselin

Náhražky sekundárních aminokyselin jsou analogy prolinu nebo N-alkylaminokyselin, které jsou odvozeny od standardních primárních aminokyselin reverzibilní ochranou páteřní amidové vazby. Fungují tak, že napodobují přirozený sklon prolinových a N-alkylových aminokyselin k narušování tvorby sekundárních struktur během sestavování peptidů. Jejich použití vede k lepší a předvídatelnější kinetice acylace a deprotekce, což má za následek vyšší čistotu a rozpustnost surových produktů, snadnější purifikaci HPLC a lepší výtěžky s menší potřebou opakovat neúspěšné syntézy. Osvědčily se zejména při syntéze obtížně řešitelných peptidů, dlouhých peptidů/malých proteinů, a cyklických peptidů, v mnoha případech umožňují výrobu peptidů, které by jinak nebylo možné vyrobit.

Novabiochem v současné době dodává tři druhy sekundárních aminokyselinových náhražek: pseudoprolinové dipeptidy; Dmb dipeptidy; Dmb/Hmb aminokyseliny (obrázek 1). Všechny fungují na stejném principu, a to tak, že do peptidové sekvence dočasně zavedou aminokyselinu, která narušuje strukturu.  Účinky mohou být dlouhodobé, přičemž tvorba struktur je často odložena až o šest zbytků nebo je zcela vyloučena.  Po sestavení peptidu se ošetřením TFA odštěpí ochranná skupina amidové vazby, čímž se regeneruje nativní sekvence obsahující primární aminokyselinu, z níž byl odvozen sekundární aminokyselinový surogát.

Obrázek 1. Sekundární strukturu narušující N-alkylové aminokyseliny.

Obrázek 2. Návrh syntézy se sekundárními náhražkami aminokyselin. Obecné pokyny pro použití náhrad sekundárních aminokyselin

• Optimálních výsledků se dosáhne, pokud jsou náhražky aminokyselin v celé sekvenci od sebe vzdáleny 5-6 zbytků.
• Optimální vzdálenost mezi náhražkou aminokyseliny a zbytkem Pro je 5-6 aminokyselinových zbytků.
• Minimální vzdálenost mezi aminokyselinovým surogátem a jiným aminokyselinovým surogátem nebo zbytkem Pro je 2 zbytky.
• Snažte se vložit aminokyselinový surogát před oblasti hydrofobních zbytků.

Pseudoproline dipeptides

Mutter's pseudoprolinové dipeptidy jsou bezpochyby nejúčinnější a nejjednodušeji použitelné sekundární náhražky aminokyselin, ale jsou vhodné pouze pro použití v sekvencích obsahujících Cys, Ser nebo Thr. Skládají se z dipeptidu, ve kterém byl zbytek Cys nebo zbytek Ser/Thr reverzibilně chráněn jako prolinu podobný TFA-labilní thiazolidin, resp. oxazolidin. Důvodem, proč je pseudoprolinový zbytek zaveden jako dipeptid, je to, že se tím vyhne nutnosti acylovat ztížený oxazolidinový dusík. To má další výhodu v prodloužení peptidového řetězce o dva zbytky v jednom kroku.

Tyto dipeptidy se velmi snadno používají: stačí nahradit zbytek Cys, Ser nebo Thr spolu s předchozím aminokyselinovým zbytkem v peptidové sekvenci příslušným pseudoprolinovým dipeptidem (obrázek 3). Při štěpení a deprotekci se obnoví nativní sekvence. Pro dosažení maximálního přínosu je důležité dodržovat výše uvedené pokyny.

Pozice pseudoprolinových zbytků v pravidelných intervalech se ukázala jako mimořádně účinný přístup pro syntézu dlouhých a amyloidogenních peptidů. Příkladem tohoto přístupu je syntéza peptidu o 95 zbytcích v pozoruhodné čistotě díky účelnému použití 7 pseudoprolinových dipeptidů při syntéze 101meru příbuzného s d2 doménou receptoru VEGF, a paralelní výrobě analogů ubikvitinu.

Pseudoprolinové dipeptidy lze zavádět stejným způsobem jako jiné deriváty aminokyselin. Pseudoprolinové dipeptidy byly spojeny pomocí fosfoniových a aminiových aktivačních činidel, jako je PyBOP^®, HBTU, TBTU, a HATU aktivační metody (metoda 1a), jakož i pomocí karbodiimidem zprostředkovaných spojovacích strategií, jako je DIPCDI/HOBt  (metoda 3-15a).

Na automatizovaných přístrojích je nejjednodušší použít stejné množství pseudoprolinového dipeptidu jako jakékoli jiné aminokyseliny, protože se tak vyhnete nutnosti přeprogramovat spojovací cykly nebo provádět jakékoli manuální zásahy do syntézy. Naprogramujte přístroj na přidání zbytku Cys, Ser nebo Thr a nezapomeňte z programu syntézy vynechat cyklus pro další aminokyselinu, protože ta bude zavedena jako součást pseudoprolinového dipeptidu.

Při použití pětinásobného přebytku pseudoprolinového dipeptidu aktivovaného fosfoniem nebo aminiem k funkčnosti pryskyřice jsou spojovací reakce obvykle dokončeny za 1 h. Lze použít i nižší přebytky činidla, ale pak je vhodné zkontrolovat úplnost reakcí pomocí aminového testu, například Kaiserova testu nebo TNBS testu.

K regeneraci cysteinu, serinu nebo threoninu z pseudoprolinu dochází v průběhu štěpné reakce TFA za použití standardních štěpných koktejlů, jako je TFA/voda/TIS (95:2,5:2,5), a je obvykle dokončena za 3 h.

Obrázek 3. Vztah mezi peptidovou sekvencí a pseudoprolinovým dipeptidem.

Protokoly pro použití pseudoprolinových dipeptidů

Metoda 1a: Ruční spojování pseudoprolinových & Dmb dipeptidů

Fosfonium/aminiová aktivace

1. Rozpusťte derivát (5 eq.) a spojovací činidlo (PyBOP^®, TBTU, HBTU, HCTU nebo HATU, 5 eq.) v minimálním objemu DMF nebo NMP.
2. Přidejte DIPEA (10 eq) a důkladně promíchejte.
3. Přidejte ihned k peptidové pryskyřici chráněné Fmoc a míchejte po dobu 1-2 h. Dokončení spojování zkontrolujte testem TNBS. Pokud reakce není dokončena, prodlužte dobu spojování nebo reakci opakujte s použitím čerstvých činidel.

Aktivace DIPCDI/HOBt

1. Rozpusťte derivát (3 eq.) a HOBt (3 eq.) v minimálním objemu DMF/DCM (2:1).
2. Přidejte DIPCDI (3 eq.) a důkladně promíchejte.
3. Aktivaci nechte 10 minut a poté přidejte k peptidové pryskyřici chráněné Fmoc a míchejte 1-2 h. Dokončení spojení zkontrolujte testem TNBS. Pokud reakce není dokončena, prodlužte dobu spojování nebo reakci opakujte s použitím čerstvých činidel.

Metoda 1b: Automatické spojování pseudoprolinových dipeptidů

Přístroje používající suché Fmoc-aminokyseliny v kartuších 

1. Naplňte prázdné lahvičky nebo kartuše příslušným množstvím pseudoprolinu nebo Dmb dipeptidu pro protokoly přístroje (tj, 1 mmol pro ABi 433 a 0,8 mmol pro Pioneer).
2. Naprogramujte přístroj tak, aby spojoval dipeptid jako zbytek Ser, Thr nebo Gly (1 h spojování, aktivace HBTU, HATU). Vynechejte cyklus aminokyselin pro další aminokyselinu.
3. Možno použít menší přebytky dipeptidů, ale bude třeba upravit dodávané objemy spojovacích a bazických činidel ve spojovacích protokolech, aby byl zachován správný poměr dipeptid/spojovací činidlo/baze (1:1:2). Případně lze přístroj naprogramovat tak, aby se po promyvacím kroku po odstranění Fmoc zastavil a dipeptid se spojil ručně přidáním roztoku aktivovaného derivátu do reakční nádoby.

Přístroje, které jehlou dávkují roztoky činidel z lahviček (ACT 396, Zinsser 350)

1. Rozpusťte derivát v DMF nebo NMP na přesně stejnou koncentraci jako standardní deriváty Fmoc-aminokyseliny v lahvičce s činidlem.
2. Umístěte lahvičku obsahující dipeptid do vhodné polohy stojanu autosampleru.
3. Naprogramujte přístroj tak, aby spojoval dipeptid jako zbytek Ser, Thr nebo Gly (1 h spojování, aktivace HBTU, HATU). Vynechejte cyklus aminokyselin pro další aminokyselinu.

Přístroje, které používají zásobní roztoky Fmoc-aminokyselin s vyhrazenými linkami rozpouštědel (Protein Technologies Symphony)

Ačkoli je naprosto možné používat předrozpuštěné roztoky pseudoprolinových dipeptidů na přístrojích, jako je Symphony, může to být poměrně neekonomické, protože linky s rozpouštědly činidel by musely být před použitím naplněny roztokem dipeptidu.  U takových přístrojů by měl být cyklus naprogramován tak, aby se po kroku promývání po odstranění Fmoc zastavil a kroky "přidat" aminokyselinu a spojovací činidlo v cyklu byly nahrazeny krokem "žádné" činidlo. Dipeptid lze poté spojit ručně přidáním roztoku aktivovaného derivátu do reakční nádoby.

Dmb Dipeptides

Dmb dipeptidy fungují přesně stejným způsobem a nabízejí mnoho stejných výhod jako pseudoprolinové dipeptidy, ale pro sekvence obsahující Gly tj.tj. rychlejší a předvídatelnější acylační reakce, vyšší výtěžky a čistotu surových produktů a méně neúspěšných syntéz. Stejně jako pseudoprolinové dipeptidy zavádí Dmb dipeptid dvě aminokyseliny najednou a vyhýbá se obtížné acylaci (Dmb)Gly zbytku.

Jejich použití je velmi jednoduché, stačí nahradit Gly zbytek spolu s předchozím aminokyselinovým zbytkem v peptidové sekvenci příslušným dipeptidem (obrázek 4). Nativní sekvence se regeneruje při štěpení a deprotekci pomocí TFA.

Pro dosažení nejlepších výsledků při použití Dmb dipeptidů je nejlepší dodržovat pokyny uvedené na obrázku 2. Dmb dipeptidy lze zavést pomocí jakékoli standardní spojovací metody.

Obrázek 4. Zásady používání dipeptidů Dmb

Fmoc-Gly-(Dmb)Gly-OH je zvláště užitečný pro zlepšení syntézy peptidů obsahujících běžně se vyskytující motiv Gly-Gly. Výroba takových peptidů je často problematická vzhledem k jejich sklonu k agregaci a obtížím při separaci těsně elučních vedlejších produktů desGly. Vložení Gly-(Dmb)Gly do peptidové sekvence má stejný přínos pro syntetickou účinnost jako pseudoprolinový dipeptid, zabraňuje agregaci a zlepšuje kinetiku acylace a deprotekce. Bylo zjištěno, že použití tohoto derivátu je nezbytné pro syntézu peptidů příbuzných nukleolinu.

Dipeptidová sekvence Ala-Gly se často vyskytuje v hydrofobních transmembránových a amyloidogenních peptidech. Proto by se Fmoc-Ala-(Dmb)Gly-OH měl ukázat jako užitečný nástroj pro syntézu takových peptidů.

Pro peptidy obsahující motiv Asp-Gly je velmi doporučován Fmoc-Asp(OtBu)-(Dmb)Gly-OH, protože jeho použití pro zavedení Asp-Gly dipeptidu zcela zabraňuje vzniku aspartimidu.

Aminokyseliny Dmb/Hmb

Na rozdíl od dříve popsaných pseudoprolinových a Dmb dipeptidů se tyto deriváty používají k zavedení zbytků chráněných páteřním amidem jednotlivě, nikoli jako dipeptidy. Po začlenění do peptidu však fungují naprosto stejně jako pseudoprolin a Dmb dipeptidy tím, že narušují tvorbu sekundární struktury, čímž dochází ke stejnému zvýšení syntetické účinnosti.

Při použití těchto aminokyselinových derivátů nejsme omezeni na zavedení páteřní amidové ochrany buď na zbytku Gly, Ser nebo Thr, jako je tomu u dipeptidových derivátů. Nevýhodou tohoto přístupu je však to, že nyní je nutné navázat vazbu na ztížený sekundární amin zbytku Hmb nebo Dmb.

Sheppard a jeho kolegové navrhli své deriváty Hmb tak, aby tento problém zmírnili. Přídavek aminokyseliny bezprostředně následující za Hmb-ochranou probíhá zpočátku prostřednictvím vnitřní bází katalyzovaného záchytu acylové složky za vzniku fenylesteru, který pak pomalu podléhá intramolekulárnímu O→N acyl transferu za vzniku požadovaného terciárního amidu (obrázek 5). Acylace (Hmb)Gly je obecně jednoduchá a funguje dobře pro většinu aminokyselin s většinou spojovacích metod. Pro ostatní zbytky Hmb Sheppard a jeho kolegové zjistili, že nejlepší výsledky poskytuje použití PSA v DCM nebo Fmoc N-karboxyanhydridů. Jiní autoři rovněž zjistili, že účinná je aktivace TBTU/HOBt/DIPEA a fluoridy aminokyselin . V praxi je spojování s objemnějším postranním řetězcem obtížnější a sterická překážka vstupující aminokyseliny se stává stále důležitějším faktorem. Při použití fluoridů kyselin se nejobtížnější případ, adice Fmoc-Val na (Hmb)Val, podařilo uskutečnit s výtěžkem 95 %, když se spojení provádělo přes noc v toluenu při 80 °C. Navzdory těmto omezením se deriváty Hmb ukázaly být pozoruhodně účinné v širokém spektru obtížných a agregovaných peptidů.

Obrázek 5. Mechanismus acylace zbytků chráněných Hmb.

(Hmb)Gly a (Dmb)Gly mají zvláštní využití při syntéze hydrofobních amyloidů a transmembránových peptidů. Tyto sekvence se velmi obtížně připravují běžnými metodami a obecně se nedají substituovat pseudoprolinem, protože zřídka obsahují více serinových nebo treoninových zbytků. Glycin se však v těchto peptidech vyskytuje často, často v sousedství hydrofobních zbytků, jako jsou Ile, Val a Ala. Proto by se substituce Gly za (Dmb)Gly nebo (Hmb)Gly měla ukázat jako velmi účinná metoda k překonání těchto problémů. Bayer a jeho spolupracovníci skutečně dokázali pomocí šesti substitucí analogického derivátu (Tmob)Gly připravit 64-reziduální transmembránový peptid v pozoruhodné čistotě.

Spojení Fmoc-(Dmb)Gly-OH lze dosáhnout pomocí standardních metod, jako je PyBOP^®/DIPEA. Po odstranění Fmoc piperidinem/DMF lze glycinový sekundární amin acylovat s Fmoc-aminokyselinami jednorázovým spojením pomocí PyBrOP^® nebo HATU, případně pomocí předem připravených fluoridů aminokyselin. (Dmb)Gly se upřednostňuje před (Hmb)Gly v aplikacích vyžadujících post-syntézní acylaci nebo fosforylaci, protože Dmb skupina postrádá potenciálně reaktivní hydroxylovou funkci.

Deprotection

Dmb a Hmb skupiny se odstraňují za běžných podmínek potřebných pro konečné štěpení a deprotekci peptidu. Doporučujeme však do štěpné směsi přidat přibližně 2 % TIS.

Poznámka: produkty štěpení Dmb a Hmb mohou způsobit modifikaci postranních řetězců nechráněného Trp. Proto důrazně doporučujeme používat Fmoc-Trp(Boc) při všech syntézách, kde se tyto skupiny používají.

Solubilizace agregovaných sekvencí

Acylace skupiny Hmb anhydridem kyseliny octové v přítomnosti DIPEA výrazně zvyšuje její kyselou stabilitu, což umožňuje generovat peptidy zachovávající ochranu Ac-Hmb přímo při štěpení pomocí TFA za normálních podmínek. Peptidy s ochranou páteře vykazují výrazně lepší rozpustnost, což usnadňuje purifikaci jinak obtížně rozpustných sekvencí pomocí HPLC.  Volný peptid lze po deacetylaci 20% piperidinem v DMF regenerovat štěpením pomocí TFA (obrázek 6).

Obrázek 6. Syntéza peptidů chráněných Ac-Hmb.

Odkazy

1. Epton R. 1993 . Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis Andover Intercept Ltd..1.

2. S, Rivier J. 1992 . “Peptides, Chemisty, Structure & Biology: . pp. 569.. Leiden: Proc. 12th American Peptide Symposium” J. ESCOM.

3. Epton R. 1990 . Innovations and Perspectives in Solid Phase Synthesis Birmingham . pp. 1.3.. UK: SPCC Ltd. .

4. Epton R. 1994. Innovation & Perspectives in Solid Phase Synthesis, 3rd International Symposium. pp. 711. Birmingham: Mayflower Scientific Ltd .

5. Bayer E. 1991. Towards the Chemical Synthesis of Proteins. Angew. Chem. Int. Ed. Engl.. 30(2):113-129. https://doi.org/10.1002/anie.199101133

6. Meldal M. 1992. Pega: a flow stable polyethylene glycol dimethyl acrylamide copolymer for solid phase synthesis.. Tetrahedron Letters. 33(21):3077-3080. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)79604-3

7. PUGH KC, YORK EJ, STEWART JM. Effects of resin swelling and substitution on solid phase synthesis. 40(3-4):208-213. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00293.x

8. BARLOS K, GATOS D, KOUTSOGIANNI S. Fmoc/Trt-amino acids: comparison to Fmoc/tBu-amino acids in peptide synthesis. 51(3):194-200. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1998.tb01216.x

9. Atherton E, Woolley V, Sheppard RC. Internal association in solid phase peptide synthesis. Synthesis of cytochrome C residues 66?104 on polyamide supports. J. Chem. Soc., Chem. Commun..(20):970-971. https://doi.org/10.1039/c39800000970

10. Quibell M, Johnson T. 2005 . Fmoc solid phase peptide synthesis: a practical approach . pp. 115.. Oxford Oxford University Press .

11. Toniolo C, Bonora GM, Mutter M, Pillai VNR. 1981. Makromol. Chem.. 182(7):1997-2005. https://doi.org/10.1002/macp.1981.021820712

12. Toniolo C, Bonora GM, Mutter M, Pillai VNR. 1981. Makromol. Chem.. 182(7):2007-2014. https://doi.org/10.1002/macp.1981.021820713

13. BEDFORD J, HYDE C, JOHNSON T, JUN W, OWEN D, QUIBELL M, SHEPPARD R. Amino acid structure and ?difficult sequences? in solid phase peptide synthesis. 40(3-4):300-307. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1992.tb00305.x

14. White Pea. 1988 . Peptides 1998, Proc. of 25th European Peptide Symposium. pp. 120.. Budapest : Akadémiai Kiadó .

15. HYDE C, JOHNSON T, OWEN D, QUIBELL M, SHEPPARD R. Some ?difficult sequences? made easy. 43(5):431-440. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1994.tb00541.x

16. von Eggelkraut-Gottanka R, Machova Z, Grouzmann E, Beck-Sickinger AG. 2003. Semisynthesis and Characterization of the First Analogues of Pro-Neuropeptide Y. ChemBioChem. 4(5):425-433. https://doi.org/10.1002/cbic.200200546

17. Shabanpoor F, Bathgate RAD, Hossain MA, Giannakis E, Wade JD, Hughes RA. 2007. Design, synthesis and pharmacological evaluation of cyclic mimetics of the insulin-like peptide 3 (INSL3) B-chain. J. Pept. Sci.. 13(2):113-120. https://doi.org/10.1002/psc.807

18. White P, Keyte JW, Bailey K, Bloomberg G. 2004. Expediting the Fmoc solid phase synthesis of long peptides through the application of dimethyloxazolidine dipeptides. J. Peptide Sci.. 10(1):18-26. https://doi.org/10.1002/psc.484

19. White P, Keyte J, Bailey K, Bloomberg G. 2003 . BIOPOLYMERS 111 RIVER ST. HOBOKEN. NJ 07030 USA : JOHN WILEY & SONS INC..

20. García-Martín F, White P, Steinauer R, Côté S, Tulla-Puche J, Albericio F. 2006. The synergy of ChemMatrix resin® and pseudoproline building blocks renders Rantes, a complex aggregated chemokine. Biopolymers. 84(6):566-575. https://doi.org/10.1002/bip.20564

21. Abu-Baker S, Lorigan GA. 2006. Phospholamban and Its Phosphorylated Form Interact Differently with Lipid Bilayers:  A31P,2H, and13C Solid-State NMR Spectroscopic Study?. Biochemistry. 45(44):13312-13322. https://doi.org/10.1021/bi0614028

22. Goncalves V, Gautier B, Huguenot F, Leproux P, Garbay C, Vidal M, Inguimbert N. 2009. Total chemical synthesis of the D2 domain of human VEGF receptor 1. J. Pept. Sci.. 15(6):417-422. https://doi.org/10.1002/psc.1133

23. El?Oualid F, Merkx R, Ekkebus R, Hameed DS, Smit JJ, de?Jong A, Hilkmann H, Sixma TK, Ovaa H. 2010. Chemical Synthesis of Ubiquitin, Ubiquitin-Based Probes, and Diubiquitin. Angew. Chem. Int. Ed.. 49(52):10149-10153. https://doi.org/10.1002/anie.201005995

24. Bavikar SN, Spasser L, Haj-Yahya M, Karthikeyan SV, Moyal T, Ajish?Kumar KS, Brik A. 2012. Chemical Synthesis of Ubiquitinated Peptides with Varying Lengths and Types of Ubiquitin Chains to Explore the Activity of Deubiquitinases. Angew. Chem.. 124(3):782-787. https://doi.org/10.1002/ange.201106430

25. Nagorny P, Sane N, Fasching B, Aussedat B, Danishefsky SJ. 2012. Probing the Frontiers of Glycoprotein Synthesis: The Fully Elaborated ?-Subunit of the Human Follicle-Stimulating Hormone. Angew. Chem.. 124(4):999-1003. https://doi.org/10.1002/ange.201107482

26. Coïc Y, Lan CL, Neumann J, Jamin N, Baleux F. 2010. Slightly modifying pseudoproline dipeptides incorporation strategy enables solid phase synthesis of a 54 AA fragment of caveolin-1 encompassing the intramembrane domain. J. Peptide Sci.. 16(2):98-104. https://doi.org/10.1002/psc.1203

27. Ehrlich A, Heyne H, Winter R, Beyermann M, Haber H, Carpino LA, Bienert M. 1996. Cyclization ofall-l-Pentapeptides by Means of 1-Hydroxy-7-azabenzotriazole-Derived Uronium and Phosphonium Reagents. J. Org. Chem.. 61(25):8831-8838. https://doi.org/10.1021/jo951108d

28. Schmiedeberg N, Kessler H. 2002. Reversible Backbone Protection Enables Combinatorial Solid-Phase Ring-Closing Metathesis Reaction (RCM) in Peptides. Org. Lett.. 4(1):59-62. https://doi.org/10.1021/ol016891c

29. Haack T, Mutter M. 1992. Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 33(12):1589-1592. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)91681-2

30. Haack T, Mutter M. 1992. Serine derived oxazolidines as secondary structure disrupting, solubilizing building blocks in peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 33(12):1589-1592. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)91681-2

31. Zahariev S, Guarnaccia C, Zanuttin F, Pintar A, Esposito G, Maravi? G, Krust B, Hovanessian AG, Pongor S. 2005. Efficient synthesis and comparative studies of the arginine and N?,N?-dimethylarginine forms of the human nucleolin glycine/arginine rich domain. J. Peptide Sci.. 11(1):17-28. https://doi.org/10.1002/psc.577

32. JOHNSON R. 1995. Prerequisites from Algebra, Geometry and Trigonometry.11-23. https://doi.org/10.1533/9780857099860.11

33. Sampson W, Patsiouras H, Ede N. 1999 . The synthesis of ‘difficult’peptides using 2‐hydroxy‐4‐methoxybenzyl or pseudoproline amino acid building blocks: a comparative study. . Journal of peptide science: . 5(9 ):403-409.

34. Cardona V, Eberle I, Barthélémy S, Beythien J, Doerner B, Schneeberger P, Keyte J, White PD. 2008. Application of Dmb-Dipeptides in the Fmoc SPPS of Difficult and Aspartimide-Prone Sequences. Int J Pept Res Ther. 14(4):285-292. https://doi.org/10.1007/s10989-008-9154-z

35. Johnson T, Quibell M, Owen D, Sheppard RC. A reversible protecting group for the amide bond in peptides. Use in the synthesis of ?difficult sequences?. J. Chem. Soc., Chem. Commun..(4):369-372. https://doi.org/10.1039/c39930000369

36. Johnson T, Quibell M. 1994. The N-(2-hydroxybenzyl) protecting group for amide bond protection in solid phase peptide synthesis. Tetrahedron Letters. 35(3):463-466. https://doi.org/10.1016/0040-4039(94)85081-x

37. Packman H. 1994. Surgical, Non-surgical Therapies. The Journal of the American Dental Association. 125(12):1540-1542. https://doi.org/10.14219/jada.archive.1994.0242

38. SIMMONDS RG. Use of the Hmb backbone-protecting group in the synthesis of difficult sequences. 47(1-2):36-41. https://doi.org/10.1111/j.1399-3011.1996.tb00807.x

39. Reicosky D. 1997. 49(1/3):273-285. https://doi.org/10.1023/a:1009766510274

40. Bacardit et al. J. 1995 . Poster 190 presented at the 15th American Peptide Symposium. [dissertation]. Nashville:

41. Ramage R, Epton R. 1996 . Proc. 24th European Peptide Symposium Mayflower Scientific Ltd . p. pp 497.

42. Quibell M, Turnell WG, Johnson T. 1994. Reversible modification of the acid labile 2-hydroxy-4-methoxybenzyl(Hmb) amide protecting group: A simple scheme yielding backbone substituted free peptides. Tetrahedron Letters. 35(14):2237-2238. https://doi.org/10.1016/s0040-4039(00)76807-9

43. Quibell M, Turnell WG, Johnson T. 1994. Preparation and Purification of .beta.-Amyloid (1-43) via Soluble, Amide Backbone Protected Intermediates. J. Org. Chem.. 59(7):1745-1750. https://doi.org/10.1021/jo00086a025