CT01
MTT-Zellwachstumstest-Kit
MTT Cell Growth Assay is a colorimetric assay that can be used for either proliferation or complement-mediated cytotoxicity assays.
Synonym(e):
MTT Formazan Assay
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About This Item
UNSPSC-Code:
12352207
eCl@ss:
32161000
NACRES:
NA.32
Empfohlene Produkte
Qualitätsniveau
Hersteller/Markenname
Chemicon®
Methode(n)
activity assay: suitable
cell based assay: suitable
Versandbedingung
wet ice
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Allgemeine Beschreibung
MTT ist ein blassgelbes Substrat, das von lebenden Zellen gespalten wird und ein dunkelblaues Formazanprodukt ergibt. Dieser Prozess erfordert aktive Mitochondrien, und selbst frisch abgestorbene Zellen spalten keine nennenswerten Mengen an MTT. Der nachstehend beschriebene kolorimetrische Assay kann sowohl für Proliferations- als auch für Komplement-vermittelte Zytotoxizitätstests verwendet werden.
Anwendung
Verfahren:
1. Führen Sie einen Lymphokin-, Mitogen- oder Komplement-vermittelten Zytotoxizitätstest nach Standardmethoden in 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten von guter optischer Qualität (z. B. Falcon) durch. Das Endvolumen des Gewebekulturmediums in jeder Vertiefung sollte 0,1 ml betragen, und das Medium (z. B. RPMI oder DMEM) kann bis zu 10 % fötales Rinderserum enthalten.
2. Am Ende des Tests 0,01 ml AB-Lösung (MTT) in jede Vertiefung geben. Durch leichtes Klopfen auf den Rand der Schale mischen.
3. Bei 37 °C inkubieren, damit die Spaltung von MTT stattfinden kann. Die optimale Zeit kann je nach Test variieren, aber vier Stunden sind für die meisten Zwecke geeignet. Nach Ablauf dieser Zeit erscheint das MTT-Formazan, das in den Vertiefungen mit lebenden Zellen produziert wird, als schwarze, unscharfe Kristalle auf dem Boden der Vertiefung.
4. 0,1 ml Isopropanol mit 0,04 N HCl in jede Vertiefung geben. Durch wiederholtes Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette gründlich mischen. Das HCl wandelt das Phenolrot im Gewebekulturmedium in eine gelbe Farbe um, die die MTT-Formazan-Messung nicht stört. Das Isopropanol löst das Formazan auf, so dass eine homogene blaue Lösung entsteht, die für die Absorptionsmessung geeignet ist.
5. Innerhalb einer Stunde wird die Absorption auf einem ELISA-Plattenlesegerät bei einer Testwellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm gemessen. Nach mehrstündiger Lagerung bei Raumtemperatur kann aufgrund der Säure/des Alkohols eine Ausfällung der Serumproteine beginnen. Das Abkühlen der Platten beschleunigt die Ausfällung. Wenn die Platten vor der Messung gelagert werden müssen, sollten sie vor der Zugabe der Säure/des Alkohols bei 4 ° C aufbewahrt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und die Säure/der Alkohol erst kurz vor der Messung zugegeben werden.
Ergebnisse:
Mit dem MTT-Test werden normalerweise 200 bis 50.000 Zellen einer typischen Zelllinie erfasst, wobei 1.000 bis 50.000 Zellen der nützliche Bereich sind. Diese Zahl kann bei anderen Zelltypen variieren. Zytotoxische Tests sollten so eingestellt werden, dass die unlysierten Kontrollzellen ein Signal von 0,2 bis 0,4 ergeben, und Proliferationsassays sollten beim Konzentrationsplateau einen ähnlichen Wert ergeben. Dies entspricht etwa 20–50.000 Zellen pro Vertiefung bei einer typischen Zelllinie.
Die Absorption ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen; die tatsächlichen Zellen absorbieren nicht signifikant, selbst bei Konzentrationen von bis zu 1 x 106 Zellen/ml.
1. Führen Sie einen Lymphokin-, Mitogen- oder Komplement-vermittelten Zytotoxizitätstest nach Standardmethoden in 96-Well-Flachboden-Gewebekulturplatten von guter optischer Qualität (z. B. Falcon) durch. Das Endvolumen des Gewebekulturmediums in jeder Vertiefung sollte 0,1 ml betragen, und das Medium (z. B. RPMI oder DMEM) kann bis zu 10 % fötales Rinderserum enthalten.
2. Am Ende des Tests 0,01 ml AB-Lösung (MTT) in jede Vertiefung geben. Durch leichtes Klopfen auf den Rand der Schale mischen.
3. Bei 37 °C inkubieren, damit die Spaltung von MTT stattfinden kann. Die optimale Zeit kann je nach Test variieren, aber vier Stunden sind für die meisten Zwecke geeignet. Nach Ablauf dieser Zeit erscheint das MTT-Formazan, das in den Vertiefungen mit lebenden Zellen produziert wird, als schwarze, unscharfe Kristalle auf dem Boden der Vertiefung.
4. 0,1 ml Isopropanol mit 0,04 N HCl in jede Vertiefung geben. Durch wiederholtes Pipettieren mit einer Mehrkanalpipette gründlich mischen. Das HCl wandelt das Phenolrot im Gewebekulturmedium in eine gelbe Farbe um, die die MTT-Formazan-Messung nicht stört. Das Isopropanol löst das Formazan auf, so dass eine homogene blaue Lösung entsteht, die für die Absorptionsmessung geeignet ist.
5. Innerhalb einer Stunde wird die Absorption auf einem ELISA-Plattenlesegerät bei einer Testwellenlänge von 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm gemessen. Nach mehrstündiger Lagerung bei Raumtemperatur kann aufgrund der Säure/des Alkohols eine Ausfällung der Serumproteine beginnen. Das Abkühlen der Platten beschleunigt die Ausfällung. Wenn die Platten vor der Messung gelagert werden müssen, sollten sie vor der Zugabe der Säure/des Alkohols bei 4 ° C aufbewahrt, dann auf Raumtemperatur erwärmt und die Säure/der Alkohol erst kurz vor der Messung zugegeben werden.
Ergebnisse:
Mit dem MTT-Test werden normalerweise 200 bis 50.000 Zellen einer typischen Zelllinie erfasst, wobei 1.000 bis 50.000 Zellen der nützliche Bereich sind. Diese Zahl kann bei anderen Zelltypen variieren. Zytotoxische Tests sollten so eingestellt werden, dass die unlysierten Kontrollzellen ein Signal von 0,2 bis 0,4 ergeben, und Proliferationsassays sollten beim Konzentrationsplateau einen ähnlichen Wert ergeben. Dies entspricht etwa 20–50.000 Zellen pro Vertiefung bei einer typischen Zelllinie.
Die Absorption ist direkt proportional zur Anzahl der Zellen; die tatsächlichen Zellen absorbieren nicht signifikant, selbst bei Konzentrationen von bis zu 1 x 106 Zellen/ml.
Der MTT-Zellwachstumstest ist ein kolorimetrischer Test, der entweder für Proliferations- oder Komplement-vermittelte Zytotoxizitätstests verwendet werden kann.
Komponenten
Reagenz A: MTT, (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), 50 mg/Fläschchen.
Lösung B: PBS, pH-Wert 7,4, 60 ml
Lösung B: PBS, pH-Wert 7,4, 60 ml
Lagerung und Haltbarkeit
Bei 2–8 °C bis zu sechs Monate haltbar. Die Mischung aus Reagenz A und Lösung B ist bei 2–8 °C bis zu zwei Wochen lang stabil.
Reagenzvorbereitung:
Für je 1.000 durchzuführende Tests 10 ml Lösung B zu einem Fläschchen Reagenz A hinzufügen. Gut mischen, steril filtern und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C aufbewahren. Hinweis: Es kann die ganze Nacht dauern, bis es sich auflöst. Lösung nicht erhitzen. Wenn für die Auflösung der Kristalle unbedingt erforderlich, den pH-Wert mit 1–2 Tropfen HCl anpassen. Das AB-Gemisch ist unter diesen Bedingungen mehrere Wochen lang stabil.
Reagenzvorbereitung:
Für je 1.000 durchzuführende Tests 10 ml Lösung B zu einem Fläschchen Reagenz A hinzufügen. Gut mischen, steril filtern und bis zur Verwendung im Dunkeln bei 4 ° C aufbewahren. Hinweis: Es kann die ganze Nacht dauern, bis es sich auflöst. Lösung nicht erhitzen. Wenn für die Auflösung der Kristalle unbedingt erforderlich, den pH-Wert mit 1–2 Tropfen HCl anpassen. Das AB-Gemisch ist unter diesen Bedingungen mehrere Wochen lang stabil.
Rechtliche Hinweise
CHEMICON is a registered trademark of Merck KGaA, Darmstadt, Germany
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