近接分析 (PLA) 的工作原理
Duolink® Proximity Ligation Assay
Duolink® ；Proximity Ligation Assay (PLA) 是一種功能強大的工具，可以原位檢測內源蛋白質、蛋白質修飾和蛋白質互作，具有高度的特異性和靈敏度。在未修改的細胞和組織中，可以單分子解析度輕易檢測和定位蛋白質目標。通常，兩種不同物種的一抗可用來檢測兩種獨特的蛋白質目標（圖 1A）。 接下來，雜交連接器寡核苷酸只有在 PLA 探針彼此靠近時才會接合，接合酶會形成滾動圈擴增 (RCA) 所需的閉合、圓形 DNA 模板（圖 1C）。 然後，PLA 探針作為 DNA 聚合酶的引物，在 RCA 過程中產生串聯序列（圖 1D）。這可使擴增的信號達到 1000 倍，但仍拴在 PLA 探針上，允許信號定位。最後，標記寡聚體與擴增子內的互補序列進行雜交（圖 1E），然後透過顯微鏡圖像分析（圖 1F）將其視為離散的斑點（PLA 信號）並進行量化。Duolink® PLA 可用免疫螢光法（即綠色、紅色、遠紅色或橘色檢測）或免疫組織化學法（即過氧化酶催化反應）在黏附的細胞、細胞釘片製劑和玻璃片上的組織切片上進行。此外，Duolink® PLA 可在血液或懸浮細胞上進行，以流式細胞計檢測，並可在多孔板（如 96 孔或 384 孔）中使用高含量篩選成像儀進行高通量分析。Duolink® PLA 的高特異性、高靈敏度和多功能性使其成為通路分析、藥物篩選動力學、IC50 測定和靶點驗證的理想方法。
圖 1.Duolink® PLA 反應示意圖。(A)兩種一抗辨識細胞中特定的蛋白質。黃色和綠色小球代表單一蛋白質的兩個表位或兩個相互作用的不同蛋白質上的表位。(B)與寡核苷酸（PLA 探針）結合的二抗與一抗結合。(C)當 PLA 探針靠近時，連接器寡核苷酸會與 PLA 探針結合並連結。(D)由此產生的閉合、迴圈 DNA 模板會被 DNA 聚合酶擴增。(E）與螢光色素結合的互補檢測寡聚體與擴增子中的重複序列進行雜交。(F)PLA信號會以離散光點的形式被螢光顯微鏡偵測到，並提供蛋白質或蛋白質互作的細胞內定位。
Detection of the Dimerization of EGFR and HER2 using Duolink® Proximity Ligation Assay
表皮生長因子受體（EGFR、ErbB1、HER1）和人類表皮受體2（HER2、ErbB2、Neu）的二聚化是一種著名的蛋白質-蛋白質互作（PPI）。EGFR 和 HER2 是受體酪氨酸激酶 ErbB 家族的成員，在調節細胞分裂和死亡方面扮演關鍵角色。影響這兩種蛋白的表達或活性的突變與各種癌症的發展有關。配體（如 EGF）與 EGFR 的細胞外域結合後，受體會活化並使其胞質尾部自動磷酸化。這會誘發與 ErbB 家族其他成員形成同源（EGFR-EGFR）和異源（如 EGFR-HER2）二聚体（圖 2）。二聚化和隨後的磷酸化導致適應蛋白的募集、細胞內信號傳遞級鏈的激活，以及最終基因轉錄的改變，這些改變可導致癌細胞增殖、血管生成、侵襲、轉移和凋亡減少。
圖 2.EGFR-HER2 二聚化示意圖。配體（如表皮生長因子 (EGF)）會與 EGFR 的細胞外域結合，導致活化和自身磷酸化。反過來，這會導致 EGFR 同二聚化（未描述）或與其他 ErbB 家族成員（如 HER2）異二聚化。Image Source：Lancet Oncol.16(15):e543-e554
Duolink® PLA Control Kit - PPI Confirms Your Experiment is Working
SK-OV3 人類卵巢癌細胞表達中等至高水平的 EGFR 和 HER2。為了確認 原位 EGF誘導的EGFR-HER2二聚化的檢測， Duolink® PLA Control Kit - PPI 被使用。每個套件包含兩片 8 孔室玻片，內含 EGF 處理過、預先固定的 SKOV3 細胞，以及小鼠抗 EGFR 和兔抗 HER2 一抗。最佳的一抗濃度已經確定，並在產品插頁文件中提供建議。在 1x PBS 中復水後，在室溫下用 0.2% Triton X-100 在 1x PBS 中透化細胞 10 分鐘，然後用 Duolink® PLA 阻斷緩衝液在 37 °C 下阻斷 1 小時。然後用兩種一抗孵育複製孔中的細胞。技術陰性對照包括分別與每個一抗孵育和不與一抗孵育，在複製孔中進行（圖 3）。洗滌後，Duolink® PLA 根據 Duolink® PLA Fluorescence Protocol。所有孔均與 Duolink® PLA 螢光協議共孵育。 抗兔 PLUS 和 抗鼠 MINUSDuolink® In Situ Detection Reagent FarRed產生PLA探針和PLA信號。使用 Duolink® In Situ Mounting Media with DAPI 裱片，並使用 GE IN Cell Analyzer 2200 獲取圖像。
圖 3.Duolink® PLA 控制套件 - PPI 玻片佈局和樣品放置。所有孔均含有經 EGF 刺激、預先固定的 SK-OV3 細胞。透化和阻斷後，1 號孔和 5 號孔同時與兔抗 EGFR 和鼠抗 HER2 一抗孵育，2 號孔和 6 號孔單獨與抗 EGFR 抗體孵育，3 號孔和 7 號孔單獨與抗 HER2 抗體孵育，4 號孔和 8 號孔僅與抗體稀釋液孵育。
當一抗在37 °C孵育2小時 (圖4A-4D) 或在4 °C孵育過夜 (圖4E-4H)時，得到了相似的PLA結果，這使用戶有更大的靈活性。當抗EGFR和抗HER2一抗同時存在時，在EGF活化的SK-OV3細胞中檢測到強大的PLA信號，表明有豐富的EGFR:HER2複合物 (圖4A, 4E)。(圖4A, 4E)儘管用EGF對SK-OV3細胞進行統一處理，但PLA信號/EGFR:HER2複合物的數量在細胞之間存在差異。這可能是由於HER2在SK-OV3細胞群中的不同表達（數據未顯示）。相比之下，當僅使用一種一抗或省略兩種一抗時，檢測到的PLA信號非常少 (圖4B-D, 4F-H)。值得注意的是，過高的一抗濃度可能會導致分別使用時PLA信號數量的增加，和/或導致無法精確量化的正性PLA信號的凝聚（數據未顯示）。因此，使用建議濃度的一抗是很重要的。這些數據顯示，使用 Duolink® PLA Control Kit - PPI可以在EGF刺激的SK-OV3細胞中檢測和定量EGFR:HER2複合物。
圖 4.使用 Duolink® PLA 檢測 EGF 誘導的 EGFR:HER2 二聚化。將經 EGF 處理固定的 SK-OV3 細胞切片與小鼠抗 EGFR 及兔抗 HER2 抗體 (A,E)、僅抗 EGFR 抗體 (B,F)、僅抗 HER2 抗體 (C,G) 或僅抗體稀釋液 (D,H) 於 37 °C 孵育 2 小時 (A-D) 或於 4 °C 過夜 (E-H)。然後使用抗兔 PLUS 和抗鼠 MINUS PLA 探針進行 Duolink® PLA。使用 DAPI（藍色核仁）和 Cy5（紅色 PLA 訊號）過濾器獲得每孔 10 張隨機 20x 圖像。圖片代表至少 5 個獨立實驗的結果。
Protein Detection Formats for Duolink® ；PLA產品
Duolink® PLA產品有螢光和明視野兩種。螢光Duolink® PLA試劑目前可用於顯微鏡和流式細胞計兩種應用格式。
螢光檢測
螢光顯微鏡是 Duolink® PLA 實驗最常用的應用格式。使用螢光Duolink® PLA試劑時，大部分程序與傳統免疫螢光(IF)相同，然而Duolink® PLA技術比IF具有更高的特異性和多功能性。Duolink® PLA 程序中新增的擴增步驟提供了更高的敏感度。
Brightfield檢測
如同傳統的免疫組織化學 (IHC)，Brightfield Duolink® PLA主要用於福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切片，但也相容於其他樣本類型。 Brightfield Duolink® PLA檢測試劑 含有用辣根過氧化酶（HRP）標記的寡核苷酸，在HRP底物存在下，形成酵素：底物沉澱物。
流式細胞計
Duolink® 流式 PLA Kit 是一種快速、強大的統計分析工具。此套件可辨識蛋白質與蛋白質之間的相互作用或亞細胞定位。將 Duolink® PLA 與流式細胞計相結合，可以高通量的方式收集定量資料。
如何開始使用 Duolink® PLA 技術
The Duolink® PLA Starter Kit PLA入門套件包含進行Duolink® PLA實驗和分析多達30個樣本所需的所有試劑。您只需提供製備好的細胞或組織樣本、一級抗體和一般實驗室設備。
A Duolink® PLA Starter Kit includes:
- 兩個 PLA 探針：一加一減 (與一抗的宿主相匹配)
- 抗體稀釋液和阻斷緩衝液
- 檢測試劑：可選 橘色
- 放大緩衝液和阻斷緩衝液li>擴增緩衝液和聚合酶
- 連接漿料和連接酶
- 清洗緩衝液A和B
- Mounting medium with DAPI
除了Duolink® PLA Protocols for ；Fluorescence, Brightfield和流式细胞仪，请务必访问我们的 资源中心 ，了解如何成功设置和执行 Duolink® PLA 实验的详细信息，包括：
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？