適用於靈敏多重檢測的 Duolink^® Proximity Ligation Assay (PLA) 多色試劑盒

Duolink^® 用於蛋白質-蛋白質互作的多色可視化和定量的聚乳酸試劑盒和試劑包

蛋白質-蛋白質互作事件

互作蛋白通常在細胞間和細胞內通訊的啟動和連鎖反應中起關鍵作用，並影響各種細胞功能和行為。/b>

互作蛋白通常是細胞間和細胞內通訊的啟動和連鎖反應的關鍵元件，並影響多種細胞功能和行為。然而，要在固定的組織和細胞中準確辨識蛋白質與蛋白質之間的互作關係是相當具有挑戰性的，尤其是對於低含量的蛋白質或每週互作的蛋白質複合物。由於發現了越來越多的螢光團和新穎的檢測技術，不同的研究領域在鑑定細胞內蛋白質互作方面取得了巨大的進展。因此，檢測這些互作關係已使我們對蛋白質功能的了解有所改善，並對健康和患病組織中的多種訊號傳導通路提供了重要的洞察力。Duolink^® PLA多色技術可在固定的組織和細胞中同時目視檢測和量化幾種不同的蛋白質-蛋白質互作。¹ 

Duolink^® PLA多色技術

Duolink^® ；PLA Multicolor Probemaker 試劑盒和試劑包提供了有效的解決方案，可直觀地識別和量化各種固定細胞和組織內多達四種不同的蛋白質-蛋白質互作。評估每種蛋白質-蛋白質互作需要兩種高度特異性的一抗。正負 PLA 探針的產生是利用 Probemaker 技術，將單一寡聚物直接結合到每個一抗上。如果每對正負 PLA 探針彼此接近 (40nM)，DNA 結合後會加入聚合酶進行滾動圈擴增，產生連接的單鏈共聚序列，最多可有 1000 個模板拷貝。Multiplex Duolink^® PLA Multicolor 技術可檢測多達四個蛋白質事件的穩定和弱互作蛋白質，檢測顏色包括綠色、橙色、紅色和遠紅色 (圖 1)。重要的是，使用標準的高含量篩選成像儀、流式細胞儀或成像流式細胞儀均可實現成像和資料分析。

圖 1： 使用 Probemaker 技術產生的直接結合一抗 (PLA 探針)，可辨識和放大四種獨特蛋白質事件的信號，偵測顏色分別為綠色、橘色、紅色和遠紅色。

Duolink^® PLA多色技術 和細胞通路分析

研究蛋白質-蛋白質互動和細胞通路分析包括各種方法和技術。常用的螢光劑和螢光顯微鏡可能會涉及到重組蛋白的使用，以及相關細胞或組織內訊號的共定位。然而，重組蛋白和共定位成像技術的使用有其限制，可能無法提供原生狀態下互動蛋白的資料。此外，研究涉及複雜訊號傳導通路的各種疾病時，可能需要分析具有微妙轉譯後修飾的蛋白質，或檢測磷酸化和非磷酸化的蛋白質。Duolink^® PLA Multicolor 技術能有效分析蛋白質與蛋白質之間的互動，以及潛在的翻譯後修飾或替代修飾。

使用多重Duolink^® PLA多色技術研究受體酪氨酸激酶HER家族

受體酪氨酸激酶HER家族由四個成員組成： EGFR (HER1 或 ErbB1)、HER2 (ErbB2)、HER3 (ErbB3) 和 HER4 (ErbB4)。重要的是，這些蛋白質在許多類型的癌症中會過度表達或突變，因此研究人員對這些蛋白質非常感興趣。² Multiplex Duolink^® PLA Multicolor 技術具有高特異性，可同時研究多達四種蛋白質與蛋白質之間的相互作用，因此可有效地用於觀察複雜的信號傳導級聯（包括 EGFR 通路）（圖 2）。

圖 2： (A)多重PLA檢測及分析EGFR信號轉譯後修飾及蛋白質-蛋白質互作的示意圖，在以EGF(+ EGF)處理或未處理的SK-OV3細胞上進行。多重 PLA 檢測 EGFR 磷酸化 (綠色)、EGFR-HER2 相互作用 (橘色) 及 HER2 磷酸化 (遠紅色)，在黏附的細胞 (B) 或脫落的細胞 (C) 上進行。分別以螢光顯微鏡或流式細胞計來收集資料。(B) 中的細胞核以 DAPI（藍色）染色。

請參考  Duolink^® PLA 多色檢測協議 ，以獲得執行實驗的進一步詳細資訊。

參考資料

1. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

2. Roskoski R. 2014. The ErbB/HER family of protein-tyrosine kinases and cancer. Pharmacological Research. 7934-74. https://doi.org/10.1016/j.phrs.2013.11.002

3. Leuchowius K, Clausson C, Grannas K, Erbilgin Y, Botling J, Zieba A, Landegren U, Söderberg O. 2013. Parallel Visualization of Multiple Protein Complexes in Individual Cells in Tumor Tissue. Mol Cell Proteomics. 12(6):1563-1571. https://doi.org/10.1074/mcp.o112.023374

4. Löf L, Ebai T, Dubois L, Wik L, Ronquist KG, Nolander O, Lundin E, Söderberg O, Landegren U, Kamali-Moghaddam M. 2016. Detecting individual extracellular vesicles using a multicolor in situ proximity ligation assay with flow cytometric readout. Sci Rep. 6(1): https://doi.org/10.1038/srep34358