Duolink^® PLA 螢光協議

本方案描述了使用 Duolink^® PLA 試劑對組織和細胞樣本中的單個蛋白質、蛋白質修飾和蛋白質相互作用進行免疫螢光檢測、可視化和定量。要熟悉 Duolink^® PLA 技術，如何優化 Duolink^® Proximity Ligation Assay，以瞭解更多詳細資訊。有關其他協議，請參閱 Duolink^® PLA Brightfield Protocol 和 Duolink^® PLA Probemaker 使用手冊。 

Duolink^® PLA Fluorescence Protocol
Results
Troubleshooting
References

材料與設備

Duolink^®PLA 試劑

請參閱 Duolink^® PLA 產品選擇指南，以瞭解具體的產品建議。簡而言之，若要進行螢光檢測的 Duolink^® PLA 實驗，需要下列 Duolink^® PLA 產品：

1. Duolink^®聚乳酸探針（一個PLUS和一個MINUS來自不同物種，與您一抗的宿主物種相匹配）。每個套件包括
   1. 聚乳酸探針 (5x) - PLUS 和/或 MINUS，視產品而定
   2. 阻斷溶液 - 用於抗體測試前阻斷樣品。用於抗體孵育前阻斷樣品
   3. 抗體稀釋液 - 用於稀釋 PLA 探針，如果需要，也用於稀釋一抗
   注意：試劑盒中的所有成分均儲存於 4 °C。

   注意：Duolink^® PLA Probemaker MINUS试剂盒可用于根据需要生成定制的 PLA 探针。詳情請參閱 Probemaker 指南。

2. Duolink^®螢光檢測試劑（選擇 綠色、遠紅色中選擇）。每個套件包括
   1. 接合庫存 (5x) - 稀釋成 1x 接合緩衝液
   2. 接合酶 (1 U/μL)- 加入以製成接合溶液
   3. Amplification Stock (5x) - 稀釋製成 1x Amplification Buffer
   4. Polymerase (10 U/μL) - 加入製成 Amplification Solution
   注意：所有組份儲存於 -20 °C。
3. 螢光清洗緩衝液（A和B）
4. Duolink^® (用於玻片，儲存於 2-8 °C)或 核染色及防褪色  (用於微孔板，儲存於 -20 °C)

。

其他材料

1. 檢測所需蛋白質的第一抗體。與 Duolink^® PLA 探針一起使用時，必須是在小鼠、兔子或山羊身上培養的。
2. 高純度水（無菌過濾，Milli-Q^® 或類似品）
3. 玻片上的樣本（細胞或組織），預先進行固定、回收及透化處理。請參閱「如何優化 Duolink^® Proximity Ligation Assay」以獲得建議和推薦，以及下列主題的詳細資訊：
   1. 實驗設計和控制
   2. 一抗的選擇和優化
   3. 樣品處理

儀器

1. 熒光顯微鏡，配備適當的濾光片、相機和圖像獲取軟件
2. 37°C培養箱
3. 軌道搖床
4. 加熱濕度室或微孔板熱傳導塊
5. 疏水性筆，用於劃定反應區域
6. 冷凍塊（用於酵素）
7. 盛載罐
8. 鑷子
9. 移液管和吸頭（從1 μL到1000 μL）
10. 與螢光顯微鏡相容的蓋玻片

Duolink^®PLA Fluorescence Protocol

以下方案適用於玻片上 1cm² 的樣品，需要 40 µL 溶液才能充分覆蓋。請根據您的反應面積和樣品數量調整用量。所有孵育步驟都應在恆濕箱中進行。所有洗滌步驟應在室溫下進行，在染色瓶中加入至少 70 毫升緩衝液，輕輕攪動。

試劑準備

1. 洗滌緩衝液 A 和 B 應在化驗開始前將一小袋的內容物溶解於高純水中，使其最終體積達到 1000 mL。溶液可在室溫下短期儲存（少於兩週），或在 4°C 下長期儲存。 注意：使用前將溶液調至室溫
2. 0.01x 洗滌緩衝液 B應在檢測開始前用高純水 1:100 稀釋 1x 洗滌緩衝液 B 製成。
3. 許多 Duolink^® PLA 試劑以濃縮湯料提供，使用前應立即稀釋。請勿儲存稀釋後的 Duolink^® PLA 試劑。

Duolink^® PLA 規範

開始前，應將樣品放置在玻璃載玻片上，並進行固定、回收和/或透化等預處理。詳情請參閱如何優化 Duolink^® Proximity Ligation Assay。

1. 阻斷
   1. 旋轉 Duolink^® 阻斷溶液。
   2. 在每個 1 平方厘米的樣品中加入 1 滴 (~40 µL) Duolink^® 阻斷液。
   3. 將玻片置於加熱濕度室中於 37 °C 下培養 60 分鐘。
2. 一抗孵育 注意：加入抗體前不要讓玻片乾燥，因為這會造成背景。
   1. 攪拌Duolink^®抗體稀釋液。
   2. 在 Duolink^® 抗體稀釋液中稀釋一抗至適當濃度。
   3. 滴掉玻片上的 Duolink^® 阻斷液
   4. 在每個樣品中加入一抗溶液
   5. 在濕度室中孵育玻片。使用您一抗的最佳孵育溫度和時間。
3. Duolink^® PLA探針孵育
   
   1. 渦旋 PLUS 和 MINUS PLA 探針
   2. 稀釋 PLUS 和 MINUS PLA 探針 1：在 Duolink^® Antibody Diluent 中以 1:5 稀釋 PLUS 和 MINUS PLA 探針。
      40 µL 反應，取 8 µL PLA 探針 MINUS 原液、8 µL PLA 探針 PLUS 原液和 24 µL 抗體稀釋液。
   3. 拭去玻片上的一抗溶液
   4. 室温下在 1x 缓冲液 A 中清洗玻片 2x 5 分钟
   5. 拭去多余的缓冲液并涂抹 PLA 探针溶液。
   6. 在 37 °C 下將玻片放入預先加熱的濕度室中培養 1 小時。
4. 連接
   注意：要等到加入連接酵素後才加入樣品。
   1. 將 5x Duolink^® 結合緩衝液以 1:5 稀釋於高純度水中並混合。
      對於 40 µL 的反應，在 32 µL 的高純水中加入 8 µL 的 5x 結合緩衝液。
   2. 從玻片上取下 PLA 探針溶液。
   3. 在室溫下，用 1x 洗滌緩衝液 A 洗滌玻片 2x 5 分鐘。
   4.  在清洗過程中，使用冷凍塊（-20 °C）從冷凍庫中取出 Ligase。
   5. 將 Ligase 以 1:40 稀釋加入步驟 (a) 中的 1x Ligation 緩衝液並混合。
      對於 40 µL 的結合溶液，在 39 µL 的 1x 結合緩衝液中加入 1 µL 的 Ligase。
   6. 拍掉多餘的洗滌緩衝液並塗上結合溶液。
   7. 在 37 °C、預先加熱的濕度室中孵育玻片 30 分鐘。
5. 擴增
   注意：等到加入聚合酶前，立即加入樣品。擴增緩衝液對光敏感。對於 40 µL 反應，在 32 µL 高純水中加入 8 µL 5x Amplification buffer。
6. 從玻片上取下結合溶液。
7. 在室溫下，用 1x 洗滌緩衝液 A 洗滌玻片 2x 5 分鐘
8. 在洗滌過程中，用冷凍塊（-20 °C）從冷凍庫中取出聚合酶。
9. 將聚合酶以 1:80 稀釋加入步驟(a)的 1x 擴增緩衝液中，並混合。
10. 拍掉多餘的洗滌緩衝液，並塗上擴增溶液。
11. 將玻片置於 37 °C、預先加熱的濕度室中培養 100 分鐘。

最後洗滌
注意：光敏感試劑。

1. 滴去玻片上的擴增溶液。
2. 在室溫下於 1x Wash Buffer B 中清洗玻片 2x 10 分鐘。01x Wash Buffer B 中清洗玻片 1 分鐘。

成像準備
注意： Duolink^® In Situ Mounting Media with DAPI 是水性的，不會凝固。可以使用透明指甲油將封面貼的邊緣密封到玻片上。

1. 拭去玻片上多餘的洗滌緩衝液。
2. 使用最小容量的Duolink^®含 DAPI 的原位掛載培養基將載玻片掛載在蓋玻片上。
3. 在螢光顯微鏡或共焦顯微鏡中分析前等待 15 分鐘，至少使用 20 倍物鏡。
4. 成像後，在黑暗中將玻片保存在 4 °C 下最多 4 天，或保存在 -20 °C 下最多 6 個月

結果

影像擷取

Duolink^® PLA 實驗的結果通常會使用熒光顯微鏡檢視，並針對所使用的檢測螢光團配備適當的濾光片。Duolink^® PLA 信號在所研究細胞的不同位置被識別為離散的螢光點（圖 1A）。單個信號的大小為亞微米級，可能位於多個焦平面。因此，可能需要在樣品的整個厚度上獲取影像。不過，只要要比較的所有影像都是在樣品的相似位置取得，也可以只在一個平面取得影像。值得注意的是，在技術陰性對照中（例如，沒有一抗，圖 1B）經常會檢測到一些信號。但是，如果每十個細胞得到超過一或兩個信號，可能需要進一步滴定一抗

。

圖 1. 使用 Duolink® PLA 檢測 A431 細胞製備液中的表皮生長因子。圖片顯示以 20 個 Z 平面為基礎的原始影像最大強度投影。PLA 信號以紅色顯示，而細胞核則以藍色顯示。核圖像在一個 z 平面上獲得。 A) 陽性反應。B) 沒有一抗的陰性對照。

使用相同的設定（曝光時間、增益、使用的濾鏡等）來擷取實驗中的所有影像是很重要的。可以使用正、負對照來優化設定。如果 PLA 信號數量很多，PLA 信號可能會合併/凝聚（圖 2）。這可能發生在研究高度表達的蛋白質時，或在影像擷取過程中因曝光過度而造成。因此，必須小心設定擷取設定，以取得單獨的 PLA 訊號。請參閱Duolink^® PLA 疑難排解指南，以瞭解如何防止信號凝聚及其他潛在優化領域的提示。

圖 2. 使用 Duolink® PLA 檢測 SKBR-3 高表現細胞 FFPE 製備物中的 Her2。圖片顯示以 20 個 Z 平面為基礎的原始影像最大強度投影。PLA 信號以紅色顯示，細胞核以藍色顯示。核圖像在一個 z 平面上獲得。 A) 陽性反應。B) 沒有一抗的陰性對照。

圖像分析

有幾種圖像分析工具可用來量化 PLA 訊號。圖像資料可分析 PLA 信號的平均螢光強度和/或每個細胞或細胞內每個區域的 PLA 信號總數（圖 3）。然後在特定實驗中報告相對於技術和/或生物對照的定量。然而，只有在 PLA 信號未凝聚且圖像像素未飽和的情況下，才能進行可靠的定量。

圖 3. 使用影像軟體進行影像分析。DAPI 染色的細胞核（藍色）會被自動偵測出來，而胞質大小則由使用者估算（綠色輪廓）。PLA 信號以紅色顯示，代表感興趣的蛋白質目標。在分析過程中，以白色圓圈標示的 PLA 訊號和以黃色勾勒的細胞核會被量化。

疑難排解

請參閱 Duolink^® PLA 疑難排解指南中的訣竅、一般疑難排解指引，以及常見問題集 (FAQ)。

請隨時與我們的技術支援團隊或您當地的銷售代表聯絡，尋求實驗上的協助。

客製化服務

您的實驗是否需要額外的客製化？讓我們為您代勞。進一步了解我們的客製化服務計畫，以加速您的 Duolink^® PLA 專案。

參考資料

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473