利用原位聚乳酸檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用

使用 Prestige Monoclonals 和 Prestige Polyclonals 以原位聚乳酸檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用

蛋白質是複雜的生物分子，對細胞結構和功能至關重要。大多數蛋白質通常會與各種分子（包括其他蛋白質）互動，以發揮其功能。這些蛋白質與蛋白質之間的互作涉及廣泛的細胞過程，包括蛋白質修飾、傳輸、訊號傳遞和細胞循環等。

蛋白質互作的研究對於表徵蛋白質在正常狀態和疾病狀態下的細胞生物學功能非常重要。有許多評估蛋白質互作的技術可供使用，例如共免疫共沉澱、pulldown 分析、交聯和遠西印迹分析。儘管這些技術提供了研究蛋白互作的強大工具，但它們缺乏以顯微鏡為基礎的原生組織或細胞分析所能達到的次細胞解析度。

近接分析法 (PLA) (Duolink^®）是一種可在原位（即 PLA）研究組織或細胞中蛋白質與蛋白質之間相互作用的技術。¹ 此方法可用於檢測、顯示和量化蛋白質與蛋白質之間的相互作用，以及檢測細胞或組織切片中的個別蛋白質和蛋白質修飾。

為了獲得可靠的 PLA 分析結果，一抗的選擇至關重要。只有特異性和選擇性高的抗體才能使 PLA 反應成功。對於一抗的一般要求是它們應該是 IgG 類的、親和純化的，尤其是對目標有特異性。

在此背景下，Atlas Antibodies 提供了大量可用于 PLA 分析的一抗资源。該目錄中有超過 18000 種多克隆抗體（Prestige Polyclonals）和 270 種單克隆抗體（Prestige Monoclonals），共針對超過 75% 的人類蛋白質編碼基因。Prestige Polyclonals 和 Prestige Monoclonals 都是使用精心設計的抗原所開發的。Prestige Polyclonals 和 Prestige Monoclonals 都是使用精心設計的抗原所開發，並透過獨特的抗體純化程序，以重組抗原作為 Prestige Polyclonals 的親和配體來達到最高等級的特異性、再現性和多功能性。Prestige Monoclonals 則是在蛋白 A 柱上進行純化。

如上所述，與其他技術相比，PLA 的主要優勢在於可使用顯微鏡在原生組織切片或細胞中以亞細胞解析度檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用。²

為了確保標本和目標抗原的形態得到最佳保存，必須仔細考慮固定方案。福馬林固定石蠟包埋組織（FFPE）切片通常可提供最佳的組織形態保存。重要的是，Atlas Antibodies 目錄中的所有抗體都經過驗證，可在熱誘導表位擷取後，用於人類（某些情況下用於齧齒動物）FFPE 樣本。

原位PLA原理

原位PLA³是以寡核苷酸標記的抗體（PLA探針）為基礎，只有當兩個探針非常接近（約30 nm）時才會產生信號。在所建立的 DNA 圈中，其中一個 DNA 探針可作為滾動圈擴增 (RCA) 的引物（圖 1 A、B）。通過加入 DNA 聚合酶，形成長的 DNA 產物，並保持附著在 PLA 探針上（圖 1 C）。完成 RCA 後，相同序列的串聯重覆可使多個檢測寡核苷酸進行雜交 (圖 1 D)。每對檢測到的 PLA 探針的信號是一個獨立的螢光點，可以在顯微鏡下觀察和量化。PLA 信號（blobs、spot）可指定到特定的亞細胞位置，並使用圖像分析軟體（例如 BlobFinder）進行量化⁴

。

圖 1. PLA 反應示意圖。與一抗孵育後，與 PLA 探針 PLUS 和 MINUS 孵化 (A)。與連接器寡聚體雜交，並使用連接酵素完成 DNA 圈 (B)。迴圈擴增 (C)。杂交荧光标记的寡核苷酸，进行信号检测 (D)。

is PLA - 一個簡短的程序

1. 組織預處理，以達到最佳抗體效能 (例如 HIER、pH=6)
2.阻斷
3.一抗孵育
4.水洗
5.PLA^® 探針孵育 37 °C 下孵育 60 分鐘
6.洗滌
7.結合 37 ℃孵育 30 分鐘.
8.擴增 37 ℃孵育 100 分鐘.
9.洗滌
10.

用Duolink In SituMounting Medium with DAPI.

下面，我們提供了三個例子，用Prestige Monoclonals和Prestige Polyclonals在FFPE人體組織切片中檢測蛋白質與蛋白質之間的相互作用。

核膜中的Emerin-lamins互作

核膜劃分了細胞核和胞質，保持了細胞核的結構完整性，並控制了細胞核和胞質之間的分子通道。⁵Emerin（EMD）是一種核內膜蛋白質，同時參與細胞核的機械完整性和組織特異性基因調控。⁶核薄片蛋白是核薄片的主要組成部分，位於核內膜的底層。⁷它們是核內膜和染色質之間的橋梁⁷為核膜提供機械支撐，維持染色質的正常組織和轉錄調控。⁸emerin和lamin之間的互作對於維持核的完整性非常重要。¹⁰

在此，我們使用抗EMD小鼠單克隆抗體AMAb90560 (1:5000, 圖.2 A）和抗 LMNA 兔多克隆抗體（HPA006660，1:30，未顯示）或 LMNB1 兔多克隆抗體（HPA050524，1:150 圖。2 B）分別顯示EMD-LMNA（圖2 C）和EMD-LMNB1（圖2 D）在分層鱗狀上皮細胞核膜上的相互作用。注意位於核膜區域的紅色免疫螢光 PLA 信號 (Figure. 2 C, D)，與 IHC 染色 (Figure. 2 A, B)相對應。圖 2 C, D）。

E-cadherin - beta-catenin 在上皮細胞膜上的互作

上皮細胞作為滲透屏障，將底層細胞與環境分隔開來。這種功能需要細胞彼此緊密連接。E-cadherin (CDH1) 是一種跨膜蛋白質，與 beta-catenin (CTNNB1) 形成複合物，在上皮細胞的細胞黏附中扮演關鍵角色。^11,12有人提出 EMT 過程是腫瘤細胞轉移擴散的重要事件，在此過程中，上皮腫瘤細胞會獲得更具動力和侵襲性的表型，並從原發腫瘤擴散。¹³

在此，我們使用Anti-CDH1單株抗體AMAb90865 (1:1000)和Anti-CTNNB1多株抗體HPA029159 (1:600)來觀察CDH1- CTNNB1在正常上皮組織膜上的相互作用，包括前列腺（圖。3 A）、輸卵管（圖 3 B）和結腸（圖 3 C）。注意上皮細胞（圖 3 A-C）的膜強度正向，而扁桃腺淋巴組織（陰性對照，圖 3 D）則沒有 PLA 信號。核用 DAPI 反染。

圖 2. 用Anti-EMD抗體AMAb90560 (A)和Anti-LMNB1抗體HPA050524 (B)進行IHC染色，顯示皮膚上皮細胞有明顯的核膜免疫活性。免疫螢光是 PLA 訊號顯示 EMD och LMNA (C) 和 EMD och LMNB1 (D) 分別在皮膚上皮細胞的核膜上有蛋白質與蛋白質之間的相互作用。

圖 3. 免疫螢光是 PLA 訊號顯示 CDH1 和 CTNNB1 在前列腺 (A)、輸卵管 (B) 和直腸 (C) 上皮細胞膜上的蛋白質-蛋白質互作。扁桃腺作為陰性對照 (D)。

Podocalyxin-like-ezrin在腎小球膜上的互作

細胞質膜包含許多種類的蛋白質，例如參與細胞結構的維護、跨膜傳輸和訊號轉導。Podocalyxin-like protein (PODXL) 是一種具有抗黏附特性的跨膜 sialomucin 蛋白。在正常腎臟中，PODXL 的功能是維持莢膜細胞中相鄰腳突之間開放的過濾通路。^18,19

PODXL和EZR都在正常的腎小球膜和輸卵管的纖毛上皮中表達。在此，我們使用 Anti- PODXL 單株抗體 AMAb90644 (1:5000) 和 Anti-EZR 多株抗體 HPA021616 (1:2500)，以 PLA 顯示這些蛋白的互作。注意在腎小球膜(圖 4 A, B)和輸卵管上皮細胞頂端膜(圖 4 C)有強烈的PLA信號。肝臟作為陰性對照（圖 4 D）。核用 DAPI 反染。

圖 4. 免疫螢光 PLA 訊號顯示 PODXL 與 EZR 在腎小球膜（A、B）以及輸卵管纖毛上皮（C）中的蛋白互作。注意腎小管 (A, B) 和輸卵管底層結締組織 (C) 中缺乏 PLA 訊號。肝臟作為陰性對照 (D)。

摘要

本文提供的數據展示了如何使用功能強大的 PLA 技術，將 Prestige Polyclonals 和 Prestige Monoclonals 用於檢測人體組織中蛋白質與蛋白質之間的相互作用 原位檢測 。以這些資料為基礎的研究可以進一步幫助我們了解蛋白質在正常和病理狀態下的功能。

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