RNA 免疫沉澱 (RIP) 常見問題解答

如何在 RNA-IP 程序中使用交聯協議最大化 RNA 品質？

甲醛會損害 DNA 和 RNA 品質，因此交聯時間應最佳化，以穩定 RNA-Protein 複合物，而不會過度損害 RNA。交聯時間可從 2 分鐘到 30 分鐘不等。反向交聯時間也相當重要，可從 45 分鐘到 4 小時不等。

如何減少 RNA 免疫沉淀實驗中的非特異性結合？

如果珠子沒有預先用 BSA 阻斷，您可以嘗試用酵母 RNA 或阻斷液中的 1% BSA 阻斷珠子。此外，Magna Nuclear RIP™ (Native) RIP kit (Cat. #: 17-10522) 或 Magna Nuclear RIP™ (Cross-Linked) (Cat. #: 17-10520) 有助於大大降低非特異結合，提高信噪比。

對於 RNA 免疫沉澱，我應該在何時進行交聯或不進行交聯？

如果您不知道蛋白-RNA 是否直接互作，建議進行交聯。這也取決於您是否能偵測到任何蛋白質結合的實驗條件，建議進行交聯以確保在您的 IP 條件下維持蛋白質與 RNA 的互作。在您的 IP 條件下，蛋白質與 RNA 的互作被證實之後，就可以測試原生 IP 條件了。

在 RIP 中，我是否應該擔心從陰性對照中獲得的總 RNA 多於我的樣品？

這可能是一個很好的指標，說明您的 RIP 是特異性的。陰性對照的 RNA 回收率比樣本高（5-10 倍）的情況並不少見。重要的是該總 RNA 池中有多大比例與您相關。換句話說，您的陰性對照中可能有更多不同且不相干的 RNA，而您的 IP 中有少數 RNA 是特異且相關的，而且數量更多。

使用 RIP RNA 進行 qPCR 分析時，如何製作 RIP/Input 的比率？我應該使用 Ct 值還是必須校準某些基因？

首先，您可以利用模板 DNA（或 cDNA）的序列稀釋液建立標準曲線。然後，利用您剛建立的標準曲線，您可以計算出輸入樣本和 RIP 樣本的相對值，再計算出比值。

有關 RIP 實驗指南、故障排除技巧和補充協議的更多資訊，請查看我們的 RNA Immunoprecipitation (RIP) 頁面。