蛋白質-DNA 互作和染色質免疫共沉淀 (ChIP) 方法
蛋白質-DNA 互作對許多生物過程都至關重要，例如 DNA 複製和修復、基因表達的轉錄和調控。了解蛋白在不同生理條件下與 DNA 序列結合的特異性相當重要。在許多探究蛋白質-DNA 互作的技術中，染色質免疫共沉淀 (ChIP) 已被廣泛用來探究蛋白質-DNA 互作。當研究人員使用 ChIP 時，細胞會與甲醛交聯，染色質會被破碎並溶出，免疫共沉淀則應用於溶出的染色質。雖然 ChIP 的讀取方法多年來已從端點 PCR 演變到高通量測序，但 ChIP 的基本原理仍維持不變。然而，這項技術仍存在一些問題，包括限制靈敏度的高背景、大量細胞輸入所帶來的挑戰，以及交聯和蛋白溶解所造成的假象。
使用改良微球菌 DNA 核酸酶 (MNase) 的 ChIC 和 CUT&RUN 的概述
。面對利用 ChIP 技術處理不溶性蛋白質的挑戰，研究人員開發了一種優雅的替代策略，稱為染色質免疫清除 (ChIC)1 。ChIC 使用特異性抗體，以蛋白 A 結合的改良微球菌核酸酶 (MNase) 為目標，偵測基因組中轉錄因子的結合位點。只有當 Ca2+ 離子存在時，經修飾的 MNase 才會特異性地在與感興趣蛋白質互動的區域切割 DNA，因此可以在抗體結合位點控制 DNA 的切割。
在 ChIC 的基礎上，研究人員進一步優化了方案，並將 ChIC 與深度測序結合，以<5 bp 的分辨率檢測原生染色質上的全基因組轉錄因子結合位點和組蛋白修飾。這種結合 ChIC 與深度測序的方法被稱為 Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease (CUT&RUN)2。
在 ChIC 和 CUT&RUN 方法中，只有目標片段被釋放到溶液中，而大部分 DNA 被留在溶液中，因此背景水平非常低（圖 1）。
圖 1：ChIC 與 CUT&RUN 方法概觀。為了進行 ChIC 和 CUT&RUN，需要收集細胞並將其與塗有 concanavalin A 的磁珠結合。用地高辛滲透細胞膜，讓特異性抗體找到目標。抗體孵育後，磁珠會被短暫清洗並與 pA-MN 孵化。細胞冷卻至 0 °C，加入含 Ca2+ 的孵育緩衝液開始消化。以螯合方式停止反應，並從上清液中萃取因裂解而釋放至溶液中的 DNA 片段。
因此，ChIC 和 CUT&RUN 只需使用 100 個細胞進行組蛋白修飾分析，以及使用 1,000 個細胞進行轉錄因子結合位點分析，即可提供高品質的資料。與 ChIP 不同的是，ChIC 和 CUT&RUN 沒有溶解性的問題，也沒有交聯造成的 DNA 可及性假像。ChIC 和 CUT&RUN 在解析度、信噪比和所需的測序深度方面都優於 ChIP。以下是 ChIC 和 CUT&RUN 與 X-ChIP-seq 相比的優勢總表（表 1）。
ChIC/CUT&RUN kits 簡介
我們開發了三種ChIC/CUT&RUN kits（Cat.#: CHR100-102)" 在ChIC和CUT&RUN技術的基礎上，增加了pG-MN或pA-MN/pG-MN蛋白雞尾酒，為抗體的選擇提供了更多的選擇。pA-MN對大多數的抗體都有較高的親和力，包括兔IgG，而pG-MN更適合對蛋白A親和力低的抗體，例如小鼠IgG1。
這些試劑盒為您的全基因組染色質蛋白互作剖析提供了以下好處：
- 與交聯 ChIP-seq 相比，信噪比極低
- 取消了交聯、聲明和高速旋轉步驟
ChIC/CUT&RUN 試劑盒可用於許多基礎和轉譯研究；ChIC/CUT&RUN&bsp;kits 可以用於許多只有有限數量細胞的基礎和轉譯應用（標準交聯 ChIP 協議不適用於此應用），例如發育生物學研究，以及分析臨床樣本或在螢光激活細胞分選或解剖後獲得的細胞。這些 ChIC/CUT&RUN 套件省去了去除不溶性物質和將細胞附著在磁珠上的聲納處理和高速旋轉步驟，因此也有可能用於高通量應用。
ChIC/CUT&RUN 试剂盒的应用数据
下面是测序数据。p> 以下是使用 ChIC/CUT&RUN kits 進行 ChIC 和 CUT&RUN 分析後的測序結果 (圖 2-3)。
圖 2：ChIC 和 CUT&RUN 分析 (H3K27me3) 的序列結果。使用抗 H3K27me3 抗体和 2x105 细胞进行 ChIC 和 CUT&RUN 分析（第 1 轨）。結果與已發表的 CUT&RUN 分析結果 (第 2 軌) 及 ENCODE ChIP-seq 資料 (第 3 軌) 進行比較。 來自 ENCODE 的 Anti-H3K4me3 ChIP-seq 結果也顯示為陰性對照 (第 4 軌)。
圖 3.ChIC/CUT&RUN 分析 (CTCF) 的序列結果。使用抗 CTCF 抗體 (Cat. #: 07-729) 和 2x105 的 K562 細胞 (1st track) 進行 ChIC 和 CUT&RUN 分析。這些結果與已發表的 CUT&RUN 分析結果 (GSE104550) (第 2 軌) 和使用相同抗體的 ENCODE ChIP-seq 資料 (GSM749690) (第 3 軌) 2.
ChIC 和 CUT&RUN 數據分析工具
我們瞭解，即使成功執行 ChIC 和 CUT&RUN 實驗，您仍可能面臨處理和分析所得數據的挑戰。我們瞭解，即使成功執行了 ChIC 和 CUT&RUN 實驗，您在處理和分析所得資料時仍可能面臨挑戰。因此，我們創造了 ChIC 和 CUT&RUN 資料分析工具，讓您可以自行執行資料分析。此工具是根據常用且經過驗證的演算法所開發，例如用於峰值呼叫的 MACS2，並考慮到是否有複製品和條碼。這個工具非常容易使用，不需要有生物資訊學的經驗，而且對ChIC/CUT&RUN 套件的客戶是免費的。
更多信息，請查看 ChIC and CUT&RUN Data Analysis Tool Overview 和 ChIC and CUT&RUN Data Analysis Tool FAQ。您可以在裝箱單、訂單確認書上找到您的訂單 ID，或致電您當地的客戶服務部進行查詢。
參考資料
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