Duolink^® ;PLA故障排除指南

建议及技巧

• 前期考虑
• 常见实验参数
• 样品储存及分析

故障排除

• 背景信号过高
• 信号低或无信号
• 成像及分析质量差

常问问题解答

• 常规问题
• 实验方案及分析
• 特殊要求
• Duolink^®探针制造商

更多支持
材料

建议及技巧

用于蛋白检测的Duolink^® PLA技术可提供一种具有一系列明确定义步骤的简易而直接的实验方法。该章节将会对可确保Duolink^® PLA实验顺利进行的一些重要注意事项进行描述。

前期考虑

• 采用在待测样品内可具有最佳一抗性能的条件。这些条件包括样品处理参数（固定、通透化、抗原修复等）、一抗效价以及孵育时间。
• 为了可对结果进行正确的评估，在实验中总是需要设置技术及可用的生物学对照。
• Duolink^® PLA Control Kit是一款可对技术进行检测并获取成功结果的便捷工具。它包含有利 Duolink^® PLA试剂进行蛋 白间相互作用观察的带有预铺板细胞的显微玻片以及一对抗体。PLA信号是具有保障的。采用该款对照试剂盒可提升Duolink^® PLA技术的可靠性或为您的实验增添更多的对照。

常见实验参数

• 永远不要让您的样品变干。在加湿箱中进行孵育步骤。
• 确保去除样品中多余的洗涤溶液。残留的洗涤溶液会造成抗体的进一步稀释并降低连接或扩增的效率。
• 可采用一支疏水笔将样品圈出来。当使用孔板玻片时，这将有助于防止孔间的溶液交叉污染。当使用组织切片时，这可以将所需的试剂体积降低到最低。
• 在合适的温度及孵育时间条件下进行所有的步骤以获取最佳的结果，特别是酶相关的步骤（连接及扩增）。
• 在进行低丰度蛋白检测时，可能需要将扩增时间进行延长。如果在这些条件下出现背景提升，可使用Duolink^®Brightfield Amplification Buffer（不含有检测寡核苷酸）独立进行扩增和检测步骤，并随后采用Duolink^®Fluorescent Amplification Buffer（含有检测寡核苷酸）进行一步30分钟的孵育。
• 在大量的洗涤溶液中进行洗涤并确保样品被完全覆盖。按要求分别使用洗涤溶液A或B。在室温进行洗涤。
• 在使用过程中将酶放置在冰冻模块中。确保其他的试剂完全解冻（如连接溶液和扩增溶液）并在使用前进行涡旋混匀。

样品储存及分析

• 所有的^® PLA探针必须储存在4 °C；包括使用Duolink^® Probemaker生成的。不要冻存，否则结果将会被显著减弱。
• 对于荧光相关的应用，在使用带有DAPI的Duolink^® Mounting Media进行封片后将玻片避光储存在4 °C最长可达4天。密封储存在-20 °C最长可达6个月。
• 不可过度曝光。荧光信号会发生聚结使得获取准确的定量分析结果更加困难。需要注意的时，信号聚结并不会影响流式细胞分析。
• 实验及对照样品应采用相同的捕获参数进行拍照成像。

故障排除

尽管注意到了所有的注意事项，也使用一些很好的建议和技巧，结果有时也不是完全会符合预期。阳性对照无信号以及高背景是免疫检测实验中最为常见的两种问题，并在使用Duolink^® PLA技术时也有可能会发生。下表列举了这些常见问题的可能诱因以及建议的解决方案。如果问题依然存在，可联系我们的技术支持热线或拨打(800) 325-5832。

A. 背景信号过高

一抗的浓度过高	采用单一识别PLA方法对每一种一抗进行独立的效价测定，因为每一种都可能会对背景信号造成不同程度的影响。
一抗的非特异性结合	如果在进行严格的条件（固定、通透化、抗体效价等）确定后背景依然存在，可尝试更换针对同样靶标的另一种一抗。
封闭不充分	确保样品被整体包含在封闭试剂中。 增加封闭孵育的时间。 采用所提供的抗体稀释液进行一抗和PLA探针的稀释，而其中含有针对Duolink® PLA优化的封闭试剂。 如果使用您自己的封闭溶液或抗体稀释液，可考虑加入20x Assay试剂（包含在Duolink®Probemaker试剂盒中）。
不充分的反应体系洗涤	增加洗涤的次数、时间和体积。 按要求分别正确的使用洗涤溶液A或B。 使用新鲜制备的洗涤溶液   由于不充分洗涤造成的高水平非特异性信号（远离细胞）。
样品变干	确保在所有的孵育步骤在合适的湿度环境中进行，并杜绝滤光片在洗涤之后以及试剂加入之前变干。
连接溶液中存在沉淀	确保连接酶缓冲液完全解冻并在使用前进行涡旋混匀。
灰尘、盐以及固定沉淀会造成高的荧光颗粒。	将您的细胞进行至少两次洗涤以确保在加入固定剂前培养基被完全去除。 使用新鲜制备的洗涤溶液。如果问题依然存在，对所有的洗涤溶液进行无菌过滤。 确保在进行封片前使用0.01x的稀释洗涤溶液B。

B. 信号低或无信号

细胞密度不正确	用于Duolink®PLA实验的最佳细胞融合度在50-70%。当细胞密度过高时会有较低的试剂渗透，导致更弱的信号。
一抗的未结合或结合不充分	确保如固定、表位修复以及通透化的参数是处于最佳的一抗性能条件。当使用两种一抗时，样品处理需要与两种一抗均兼容。 采用单一识别PLA方法对每种一抗进行独立的效价测定。
不正确的孵育温度	在合适的温度条件下进行所有的步骤，特别是酶相关的步骤（连接及扩增）。
多余洗涤溶液的去除不充分	残留的洗涤溶液会造成抗体的进一步稀释并降低连接酶和聚合酶的功效。在加入新的试剂前吸干或轻轻拍干多余的溶液。
洗涤溶液使用不当	将洗涤溶液平衡至室温。 按要求分别使用洗涤溶液A或B 洗涤溶液温度的影响
使用错误的滤光片用于图像捕获	Amplification Green中的荧光基团具有495 nm的激发波长以及527 nm的散射波长，并可使用与如Cy2或FITC相同的滤光片进行检测。 Amplification Orange中的荧光基团具有554 nm的激发波长以及579 nm的散射波长，并可使用与如Cy3相同的滤光片进行检测。 Amplification Red中的荧光基团具有594 nm的激发波长以及624 nm的散射波长，并可使用与如Texas Red相同的滤光片进行检测。 Amplification Far Red中的荧光基团具有644 nm的激发波长以及669 nm的散射波长，并可使用与如Cy5相同的滤光片进行检测。 确保使用正确的滤光片。
连接不充分	保持连接孵育的时间和温度。 在加入连接试剂前确保没有过量的洗涤溶液残留在滤光片上。 确保连接酶具有活性（如一直保存在-20 °C）并使用了正确的试剂稀释条件。 在使用前新鲜制备稀释液；不要让其在使用前与酶混合超过五分钟。
扩增不充分	如果相互作用的量极低，则信号也会非常的弱，因为仅比阴性对照高一点。 在加入扩增试剂前确保没有过量的洗涤溶液残留在滤光片上。 针对低丰度的互作调整扩增的时间（可在37 °C最长过夜）。 确保聚合酶具有活性（如一直保存在-20 °C）并使用了正确的试剂稀释条件。 在使用前新鲜制备稀释液；不要让其在使用前与酶混合超过五分钟。

C. 成像及分析质量差

信号的聚结	延长的扩增时间会引起信号的聚结。采用推荐的连接及扩增步骤时间。     过高的一抗效价也会引起信号的聚结。采用单一识别PLA方法对每种一抗进行效价测定。 成像过程中的过度曝光也会引起信号的聚结。在图像拍摄过程中不要使用自动曝光设置。
自发荧光	成像过程中的过度曝光会引起自发荧光。在图像拍摄过程中不要使用自动曝光设置。 有事自发荧光是细胞或组织样品固有的。尝试改变检测的颜色，如在可能时从绿光至远红光。 提高洗涤的次数或洗涤溶液B的体积。

常问问题解答

该章节为一些常见问题（FAQ)提供了答案。然而，部分信息是保密且不能被披露的。这包括如试剂及溶液的特定组成、寡核苷酸的长度及序列，或是Duolink^® PLA探针以及Duolink^® PLA Probemaker试剂盒的偶联化学试剂等。

常规问题

1. 邻位连接适用的最短和最长距离是多少？
   所有的Duolink^® PLA产品都是被设计用于邻位检测的。当使用二抗方法时，理论上在两种靶标蛋白（表位）间产生信号的最长距离为40 nm。这些数据是基于抗体的平均直径约为10 nm而计算出来的。Duolink^® PLA理论上可检测距离在0 nm之内的两个表位，只要两种单抗可发生结合并且不存在位阻。

2. Duolink^® PLA产品或试剂可持续多久？
   • 检测试剂盒中的所有试剂必须总是被保存在-20 °C。这一点对于连接酶和聚合酶尤为重要，它们如果被拿出冰箱后需要被保存在预冷的冷冻模块中（冷冻模块可保持酶处在-20 °C；而冰浴并不能实现这一点）。Duolink^® PLA探针、抗体稀释液、封闭液以及封片液必须被保存在+4 °C。不要将PLA探针或由Probemaker生成的探针进行冷冻。
   • 只要保存在-20 °C，我们可在您收到Duolink^® PLA Probemaker后提供6个月的保障。一旦发生偶联后，我们的经验是绝大多数抗体在+4 °C的有效期为三至六个月。这种情况下，它将非常依赖于抗体是否需要特殊的保护剂。
3. 我是否可以将Duolink^® PLA用于活细胞或非固定的组织样品？
   • Duolink^® PLA一直是针对固定细胞和组织而优化的。
   • 通透化对于抗体和探针找寻到其靶标是必需的。
   • 此外，一些Duolink^® PLA试剂（酶、DNA寡核苷酸）可能会被活细胞中活性机制所摧毁。
4. 我是否可以将PLA探针与传统的免疫荧光结合使用？
   是的。  只要所有的抗体来自不同的物种并且荧光检测系统使用的是不同颜色的荧光，就可以将Duolink^® PLA探针与传统的免疫荧光技术结合使用。

Duolink® PLA实验方法或分析

1. Duolink^® PLA探针是什么？
   • Duolink^® PLA探针是偶联有PLUS或MINUS寡核苷酸的二抗。
   • 这些二抗源自于养殖的驴（Equus asinus domesticus）。
   • 通过使用抗小鼠、抗兔和抗山羊的多克隆抗体而制备。
   • 与其他物种具有最低的交叉反应性。
2. 所需的最低和最高细胞或组织数是多少？
   • 原则上，Duolink^® PLA实验所需的最低细胞数是一个细胞。实际所用的实际最低细胞数取决于您的特定应用。
   • 最大数量很难确定。如果细胞密度过高，则抗体和试剂可能很难触及到样品中心的细胞。最佳的细胞融合度是50-70%。
   • 对于组织样品，则没有最低的数量。而从最高30 µM厚的组织切片中获取过成功的结果。最佳厚度是5-10 µM。
   • 实验的成功取决于组织区域及其预处理（如固定、通透化、表位修复）。
3. 在哪一步可以停止实验过程？或者实验过程中哪里是比较好的暂停点？
   • Duolink^® PLA实验过程中有几处可以暂停。其中包括：
     • 在固定后，样品可在4 °C被放置在1x PBS中数天
     • 封闭过程及一抗孵育可过夜进行。取决于不同的一抗，孵育时间可从半小时至过夜。观察到即便是某种一抗推荐的孵育时间更短，也可以降孵育时间延长至4 °C过夜。
   • 在这些过程完成后。
     • 对于荧光检测：最终洗涤步骤之后以及封片之前的室温玻片干燥可过夜进行。封好的玻片在使用前可在+4 °C保存最长达四天或密封保存在-20 °C达数月。请注意玻片应当避光保存！
     • 对于HRP检测（明场）：在最后的脱水步骤之后，玻片应被放在二甲苯中或继续进行封片。一旦进行封片后，玻片需要进行干燥，而这通常是过夜的。
   • 注意：连接和扩增条件是经过优化并不能进行改变的。进行极低丰度蛋白检测或流式细胞应用可能会有例外，但如果扩增和检测过程没有分别进行则可能也会导致更高的背景。
      
4. 改变孵育时间和温度的影响会是什么？
   Duolink^® PLA实验方法已被优化在不影响结果质量的前提下可在最短的时间内获得结果。孵育的时间和温度优化是其中非常重要的因素，因此采用推荐的条件对于获取最佳结果是必需的。
   
   
5. 如何进行单一识别实验？
   在进行单一识别实验时，您需要一种针对您特定靶标蛋白的一抗以及两种均针对您一抗物种的PLA探针（例如，如果您的一抗是在兔子体内产生的，则您需要抗兔的PLUS及MINUS PLA探针）。Duolink^® PLA实验的其余部分则按正常进行。
   
   
6. PLA信号可持续多久？  或PLA信号稳定吗？或如果需要保持PLA信号，我该怎样保留我的玻片？
   • 我们强烈推荐使用带有DAPI的 Duolink^® PLA Mounting Media用于荧光应用，因其可帮助保留PLA信号。当使用其他封片试剂时PLA信号会发生淬灭，甚至会在加入至样品后立即发生。
   • 在进行显微镜分析前，采用带有DAPI的 Duolink^® PLA Mounting Media进行封片的玻片可在4 °C避光保存最长达4天。
   • 未封片的玻片也可以被保存在-20 °C经过周末。
   • 如需长期保存，我们推荐在盖玻片的边缘周围涂上透明的指甲油。通过这样方法，玻片可在-20 °C最长保存半年，尽管正常情况下信号会随着时间发生略微的淬灭。如果玻片已通过显微镜进行过分析，则可预计到会发生更多的淬灭。
   • 当采用非水相（基于二甲苯）、永久型（坚固的）封片剂对玻片进行封片用于明场应用时，样品可保存在室温条件下而PLA信号将会持续达数年。

特殊要求

1. 使用Duolink^® PLA探针时对一抗有哪些要求？或者推荐哪种抗体？
   • 相应的一抗应当是：
     • IgG类的
     • 特异性针对待测靶标的，最好是通过亲和纯化的
     • 宿主必须是小鼠、兔或山羊
     • 单克隆或多克隆抗体
     • 通过IF或IHC验证；现已有PLA验证的抗体。
   • 我们可提供超过70,000种可供您选择的一抗。
   • 我们已与Bethyl Laboratories达成合作以提供用于PLA的验证一抗组合。
2. 我应该使用怎样浓度的一抗？
   如果您已经具有使用IHC或IF的检测经验，可开始采用相同的一抗浓度。有时可能需要进行一抗的效价测定。

Duolink^®探针制造商

1. 我们的抗体是来自于小鼠、兔和山羊之外的物种。  我还能使用Duolink^® PLA吗？
   是的。  我们可提供将PLA寡核苷酸臂PLUS或MINUS偶联至您目标抗体的Duolink^® PLA Probemaker试剂盒。  这样您就可以构建您自己的PLA探针，并随后与Duolink^® PLA试剂配合使用用于对您的目标蛋白进行检测。
2. 我的两种一抗是来自于同一物种的。我还能使用Duolink^® PLA吗？
   是的。  我们可提供将PLA寡核苷酸臂PLUS或MINUS偶联至您目标抗体的Duolink^® PLA Probemaker试剂盒。  这样您就可以构建您自己的PLA探针，并随后与Duolink^® PLA试剂配合使用用于对您的目标蛋白进行检测。  这便能实现蛋白同源二聚体的检测。
3. 什么时候该使用Probemaker试剂盒？
   Probemaker试剂盒可实现PLA寡核苷酸（PLUS或MINUS）与任何抗体的偶联。因此，PLA探针可通过使用Probemaker从用于直接检测的一抗或间接检测的二抗进行生成。
   • 当一抗的宿主不是小鼠、兔或山羊时
   • 当使用来自同一物种的两种一抗时
   • 当使用与样品相同宿主物种（如“小鼠用于小鼠”）的一抗时
4. 是否有推荐用于Probemaker试剂盒的抗体？
   • 1 mg/mL的抗体浓度
   • 单次偶联的抗体量为20 mg。
   • 抗体需要不含添加剂
5. 当使用Duolink^® PLA Probemaker时，是否可以使用低于1 mg/mL的一抗浓度？
   • 每款Duolink^® PLA Probemaker试剂盒都含有可在浓度为1 mg/mL时偶联20 ug抗体的试剂。强烈推荐使用该浓度的抗体。
   • 更低或更高的浓度并不能保证获取好的结果。
   • 如果抗体浓度过低，可通过离心设备进行超滤而对其进行浓缩。注意在该过程中可通过后续离心而重复加入所需缓冲液而对缓冲液进行更换。
   • 如果抗体浓度过高，可在不含胺的溶液（如PBS)中进行稀释
6. 我的一抗中含有许多的添加剂。该怎么办？
   • 对于使用Duolink^® PLA Probemaker前的抗体预处理，我们参考标准的过程。
   • 如需更换缓冲液或去除如叠氮化物或海藻糖这样的低分子量添加剂，您可进行针对PBS的透析或在平衡了PBS的离心柱（Sephadex G25）上进行凝胶过滤。
   • 如需去除如BSA或凝胶这样的高分子量添加剂，我们推荐通过Protein A或Protein G进行纯化。采用可能会影响抗体活性的低pH值洗脱液对抗体进行洗脱。  我们推荐立即加入具有中性pH的强缓冲液。  采用该纯化方法将总会造成抗体的损失。
7. 我该怎样对偶联抗体进行稀释？
   抗体的工作浓度将主要取决于抗体的灵敏度、样品类型以及样品的预处理。  我们一般推荐使用可提供较好IF或IHC结果的浓度作为起始浓度。  有时可能需要进行效价的测定。
8. 我能将直接偶联的一抗与PLA探针进行结合吗？
   是的。  可以将直接偶联的抗体与Duolink^® PLA探针进行结合，只要它们其中一个是PLUS而另一个是MINUS并且不存在交叉反应性（也就是PLA探针应与您直接偶联的一抗针对不同的物种）。

更多支持

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• 针对您检测的描述
• 结果的图像
• 已进行的（如有）对照（阳性/阳性，生物学/技术型）
• 之前的IF/IHC结果（如有）