Quantitative real-time PCR (qPCR) 可讓您即時量化來自多個樣本的 DNA 濃度，方法是在完成&...nbsp;染色質免疫共沉淀 (ChIP) 分析 和樣本純化。在 qPCR 中，DNA 樣本與引物、聚合酶、寡核苷酸和檢測螢光劑（如 TaqMan® （螢光供體：淬火雜交）探針或 SYBR® Green夾雜染料（無需特定探針））共孵育。DNA 樣品透過 DNA 聚合酶進行循環擴增，其中上一循環中的產物會成為下一循環的模板，因此在最理想的反應中，每一循環中擴增的 DNA 都會加倍。為了成功進行分析，請確保您的引物能以 95% 以上的效率擴增預期的序列，並且不會形成二聚體，以免削弱以 SYBR® Green 技術為基礎的 qPCR 的特定信號。
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用於 ChIP-qPCR 的 SYBR® Green 和 TaqMan® 檢測方法比較
qPCR 常用的兩種檢測方法是 SYBR® Green 技術和 TaqMan® probe 技術。SYBR® Green 是一種 DNA 結合染料，當與雙鏈 DNA 結合時，螢光會急劇增加。因此，螢光信號會隨著雙鏈 DNA 複製份數的增加而增加。也可以使用 TaqMan® 探針進行檢測。在這種方法中，一個報告螢光團和一個淬滅螢光團被整合到一個單一的、序列特異的探針中，該探針可以識別您的 PCR 擴增子。在游離探針中，報告器的信號會因接近淬火螢光團而被淬滅。與擴增組雜交時，DNA 聚合酶的 5'→3' 外切酶活性會降解探針，並釋放出與可用於雜交的模板分子數量成比例的游離螢光體。在上述兩種 qPCR 技術中，螢光信號都遵循一個線性階段，當反應中的一個組份成為限速時，螢光信號隨後會進入一個高原階段。
qPCR 提示
在開始進行 qPCR 之前，您必須使用蛋白酶 K 和加熱來反轉輸入和測試樣本中的交聯。在某些情況下，您可能需要通過進行溶劑（酚：氯仿）提取來純化 DNA。
螢光信號指示每個樣本的週期臨界值 (Ct)*。Ct 是螢光信號超過背景的線性相位點。Ct 取決於您樣本中的 DNA 含量。如果您的樣本含有相對較多的 DNA 目標物，則超出背景所需的週期較少，Ct 也會較低。相反，如果您的 DNA 目標物含量低，則需要進行更多循環才能達到 Ct。用 qPCR 進行 ChIP 分析時，最好使用較稀釋的 DNA 樣本（而不是高濃度的模板，高濃度的模板會抑制 Taq 聚合酶）。因此，請遵循可用的規程來描述用 qPCR 分析 ChIP'd DNA 的典型用量，例如從 50 µL ChIP 樣品中抽取 2µL，以避免在反應中引入 PCR 抑制劑。
*注意： 「定量 Real-Time PCR 實驗發佈最低資訊」（MIQE）中的現行指導方針建議，在報告 qPCR 數據時，應使用 「定量週期」（Cq）來替代 「週期閾值」（Ct）。如需瞭解有關此主題的更多資訊，以及執行適當對照、資料分析標準和錯誤報告的建議，請造訪 http://www.rdml.org/miqe。
確定qPCR 反應的效率
要從您的 qPCR 分析中提取有意義的資訊，必須測量某些參數，以確保分析正常工作。首先，測試 qPCR 反應的效率 (E)。qPCR 反應的效率通常以百分比值表示，表示每個週期中模板被擴增的百分比。測試反應效率的最佳方法是製作標準曲線，方法是對已知濃度的樣品進行五點序列稀釋，並繪製相應的 Ct 值，以產生標準曲線。
對於用於 qPCR 優化實驗的 DNA 標準，您可以使用片段化、純化的基因組 DNA，或更方便的從染色質中分離的 DNA 作為輸入樣品。輸入樣本可以是染色質樣本總量的一小部分（2 到 5%）。染色質樣本應該經過蛋白酶 K-消化、交鏈反轉和純化，以便為分析開發或效率計算提供合適的對照材料。在 qPCR 儀器軟體中，如果您選擇您的樣本類型為 「標準」，效率通常會自動計算並報告。
反應效率可用公式計算：
效率 (E) =10-1/slope of standard curve
% Efficiency = (E-1) x 100
對於優化的反應，效率應該在 95% 到 105% 之間。如果您的效率不在這個範圍內，您可能需要探討實驗誤差的潛在來源：
- 每個稀釋品運行至少三次重複，並可能調整稀釋度
- 使用最佳化的緩衝液
- a。如果可能，使用商用母液，以獲得更一致的結果
- b。運行一個不含 DNA 的樣本，以測試緩衝液中的污染物
- 使用精心設計的引物 - 理想情況下，Ct 值應在 18 到 30 之間。
- 如果您的效率仍未達到最佳，請考慮以下可能的低效率原因：
- a.Amplicon 太大（保持在 65 到 150 個基本位元之間）
- b.引物完整性差（使用新引物）
- c.引物太濃（改變引物稀釋以避免二聚體）
- d.模板 DNA 中的苯酚、鹽或乙醇造成污染
- e.儀器基線或閾值設定不當
- f.無模板對照中的污染（使用專用移液管、紫外線輻照設備、新鮮的 Milli-Q® 水等）
- f、並設置在獨立的房間）
ChIP-qPCR 資料分析
分析 qPCR 資料有兩種方法：絕對定量和相對定量。
絕對定量
絕對定量允許確定給定數量的樣品中有多少 DNA，而不需要與其他樣品進行比較分析。為了進行此分析，您應該做以下工作：
- 對已知濃度的樣本進行序列稀釋（經定量、純化的輸入 DNA）
- 每個稀釋液至少包含三個複製本
- 將這些標準液與您的測試樣本一起進行測試
- 建立標準液譜。li>建立樣品對數量與 qPCR 分析所得 Ct 值對比的標準曲線
- 進行回歸分析以確定標準曲線的等式，並使用此等式計算未知樣品中的 DNA 量。
測試樣本中目標 DNA 的數量應在 qPCR 分析的線性動態範圍內。
從外推法 Ct 測定得出的擬合值可以報告為 「回收的納克 DNA」、「輸入的百分比」、「拷貝數」、「平均量 」以及其他描述分子數量的變體。
相對定量
在相對定量分析中，測試樣本表示為相對於對照樣本（使用正常純化 IgG 或模擬 IP 進行免疫共沉淀）的倍數變化。測試樣本也可以表示為在實驗條件下已知能維持穩定表達水平的參考基因的百分比，類似於在 Western 印迹分析中使用「看家」蛋白，或在 qRT-PCR 表達分析中使用看家基因 cDNA。已知未被免疫沉澱蛋白佔據的 DNA 位點（陰性位點）可以這種方式作為參考基因，與已知的、被佔據的、陽性對照 DNA 位點進行比較。
- 計算每個 ChIP 的輸入百分比：
%Input = 2(-ΔCt [normalized ChIP]) - 將陽性基因座的ΔCt 值歸一化為陰性基因座的ΔΔCt 值 (ΔΔCt)，方法是將陽性基因座得到的ΔCt 值減去陰性基因座的ΔCt 值：
(ΔΔCt = ΔCt陽性 - ΔCt 陰性) - 計算 ChIP DNA 中陽性基因座序列對陰性基因座序列的富集倍數：
Fold enrichment =2ΔΔCt
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