具有挑戰性的樣本的陣列 CGH 分析

Sunny Song¹, Jim Collins¹, Steve Michalik², Chad Brueck²

¹Agilent Technologies, 5301 Stevens Creek Blvd., Santa Clara, CA, 95051, ²MilliporeSigma, 3050 Spruce Street, St. Louis, MO, 63103 AACR, April 2007 Poster # 3792

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Introduction

近年來，基於陣列的比較基因組雜交（aCGH）技術不斷改進，以更高的解析度來確定染色體變化¹。然而，這項不斷演進的技術受到大量 DNA 輸入需求的障礙--處理一個 CGH 陣列通常每個樣本至少需要 150,000 份人類基因組拷貝或 0.5 μg。從病人身上收集到的可用組織，例如小針頭活檢，通常會限制下游分析的範圍。GenomePlex^® whole genome amplification (WGA) 提供了一種方法，可以減少 aCGH 及其他分析所需的 DNA 量。WGA 產品也被證實可在 BAC 陣列^{2, 3}和其他寡核苷酸陣列平台⁴上使用。DNA 擴增可以擴大應用的數量和廣度，例如微陣列分析，以分析納千克量的 DNA，甚至是單細胞。此外，也許更有趣的是，GenomePlex WGA 能讓研究人員從平均大小小於 1 kb 的片段樣本中，擴增出具有代表性的基因組。

結果

100 ng 至 1 ng 輸入 DNA

圖 1. 來自 Agilent 人類基因組 CGH 105A 微陣列的輸入滴定資料

每個面板 (A-F) 並排顯示染料交換圖。極性 +1 (Cy5-HT29/Cy3-Female) 顯示在左側，極性 -1 (Cy5-Female/Cy3-HT29) 顯示在右側。這些 CGH 圖將正常女性 DNA 與 HT29 人類結腸癌細胞株 DNA 進行比較，HT29 有已知的 p 臂缺失（水平移向零線左側）、q23.3-24.33 區域的 q 臂擴增（水平移向零線右側），以及 q23.1 的局灶缺失。在這些樣本上進行染料交換（在樣本間切換染料標籤），以證明結果並非染料偏差的影響。衍生對數比標準差 (DLRSD) 值顯示在圖表下方。表 1 提供了陣列品質指標。

A: 從 100 ng 輸入中擴增
B: 從 50 ng 輸入中擴增
C: 從 10 ng 輸入中擴增
D: 從 1 ng 輸入中擴增
E: 未擴增

。

表 1： 陣列效能指標 / QC 結果 (進一步說明請參閱腳注)

	SNR-Cy3	SNR-Cy5	BG Noise-Cy3	BG Noise-Cy5
Amplified (100 ng input)	137	192	1.9	2.6
放大 (50 ng 輸入)	118	190	2.4	2.9
放大 (10 ng 輸入)	94	202	2.4	2.3
放大 (1 ng 輸入)	142	221	1.7	2.2
未放大 (500 ng 輸入)	155	190	2.0	3.1

Gel image, sonication time course of genomic DNA

圖2. 1.2%琼脂糖凝膠電泳分析片段DNA

DNA 片段大小是在用 GenomePlex WGA 擴增之前透過凝膠電泳確定的。人類女性基因組 DNA 和 HT29 基因組 DNA 都會產生高分子量的完整帶 (> 12,000 bp)，而 DNA 經 5 到 120 秒的不同聲波處理，會產生不同大小的 DNA 片段。90秒聲納的樣本（200-1500 bp，第5和第9泳道）用於隨後的aCGH分析。

第1泳道& 7：分子量標記
第2泳道：完整的雌性 DNA (> 12,000 bp)
Lane 3：雌性 DNA 聲化 5 秒 (400 - 10,000 bp)
Lane 4：雌性 DNA 聲納 30 秒 (250 - 1,500 bp)
Lane 5：雌性 DNA 聲納 90 秒 (200 - 1,200 bp)
Lane 6：雌性 DNA 聲納 120 秒 (150 - 600 bp)
Lane 8：完整的 HT29 DNA (> 12,000 bp)
Lane 9：HT29 DNA 音波處理 90 秒

GenomePlex WGA 可以擴增 1kb 以下的 DNA，結果等於完整的 DNA。

圖 3. 安捷倫人類基因組 CGH 44B 微陣列的 8 號染色體在人類結腸癌細胞株 HT29 與正常女性中的 CGH 分析觀點

由完整 HT29 DNA（A）和經音波處理（90 秒）的 HT29 DNA（B）產生的 WGA 結果顯示，8p 臂上有相同的已知缺失（水平移動到零線左側），8q 臂上的 8q23.3-24.23 區域有擴增（水平移動到零線右側），8q23.1 有一個病灶缺失（水平移動到零線左側，用藍色虛線框勾出）。對應的放大基因視圖來自完整 DNA (C) 和片段 DNA (D)，聚焦於 Chr8 q22.2-23.1，顯示一個明顯的 ~1.5 MB 刪除（粗線標示），涉及鋅指蛋白 ZFPM2 和腫瘤抑制因子 LRP12，先前已在 BAC 陣列為基礎的分析中報告。

A: 擴增完整 DNA 的 Chromosome 8 檢視，比較 HT29/Female (50 ng 輸入)
B: 擴增聲納 90sec DNA 的 Chromosome 8 檢視，比較 HT29/Female (50 ng 輸入)
C: 放大基因檢視面板 A (12 MB 縮放視窗)
D：

使用GenomePlex擴增或未擴增的DNA，以Agilent人類基因組CGH 244K微陣列鑒定病灶缺失。

圖 4. Agilent 244K 分析 (5) 人體冷凍乳房腫瘤與正常女性的 CGH 分析觀點

由 244K 微陣列分析產生的散點圖 (染色體檢視) 顯示，在擴增 (A) 和未擴增 (B) 的樣本中，13 號染色體 p13.1 區域都有一個病灶缺失 (水平移向零線左側，以藍色虛線方框勾勒)。對應的放大基因檢視 (C = 擴增，D = 未擴增)，聚焦於 13p13.1 內包含病灶缺失的 3.7 MB 視窗。

A: 乳房腫瘤 vs. 正常女性 Chr13, WGA 擴增 (50 ng input)
B: 乳房腫瘤 vs. 正常女性 Chr13, 未擴增 (50 ng input)

使用 BRCA2 基因特異性定量 PCR 對 aCGH 乳腺癌數據進行驗證

使用 BRCA2 基因特異性定量 PCR 對 aCGH 乳腺癌數據進行驗證

圖 5： 以 BRCA2 基因第 2、3 及 26 (6) 個外子為目標的三組 SYBR Green 定量 PCR 引物平均值顯示，乳房腫瘤 DNA 與正常女性 DNA 的週期相差 1.54。與正常樣本相比，腫瘤樣本中 BRCA2 基因的代表性下降了 2.9 倍 (2^1.54)，這驗證了 13 p13.1 局灶雜合缺失。

腳註

陣列效能/QC 指標 (CGH Analytics 3.4 軟體 QC 指標)

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DLRSD	參數 Log2 比率標準 偏差	連續探針之間的對數比率差異的標準偏差 除以 sqrt(2)。此指標 計算陣列的探針對探針對數比率雜訊。	優：<0.2 良：0.2-0.3 差：>0.3
BGNoise	背景 雜訊	此指標的計算方式為標準差剔除特徵 非均勻離群、飽和特徵 和特徵 群離群	優秀：5 好：5-10 差：>10
SNR	信號雜訊比	此指標的計算方式為信號強度除以 BGNoise。	優秀：>100 良好：30-100 差：<30

結論

這種擴增方法允許較少量（納克量）的起始材料，並且能夠通過連續的再擴增使珍貴的樣本永生。除了省去最初的限制性酵素消化外，WGA DNA 還可以直接納入寡核苷酸-aCGH 工作流程，而不會與 Agilent 推薦的方案有任何重大偏差。擴增材料產生的高品質陣列 CGH 資料與未擴增基因組 DNA 樣本的結果相匹配。未來的實驗將著重於從組織樣本，包括 FFPE 和 LCM 樣本中產生高品質的基因組圖檔 ⁷.

。

參考資料

1. Barrett MT, Scheffer A, Ben-Dor A, Sampas N, Lipson D, Kincaid R, Tsang P, Curry B, Baird K, Meltzer PS, et al. 2004. Comparative genomic hybridization using oligonucleotide microarrays and total genomic DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(51):17765-17770. https://doi.org/10.1073/pnas.0407979101

2. Johnson NA, Hamoudi RA, Ichimura K, Liu L, Pearson DM, Collins VP, Du M. 2006. Application of array CGH on archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues including small numbers of microdissected cells. Lab Invest. 86(9):968-978. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700441

3. Little SE, Vuononvirta R, Reis-Filho JS, Natrajan R, Iravani M, Fenwick K, Mackay A, Ashworth A, Pritchard-Jones K, Jones C. 2006. Array CGH using whole genome amplification of fresh-frozen and formalin-fixed, paraffin-embedded tumor DNA. Genomics. 87(2):298-306. https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2005.09.019

4. O'Geen H, Nicolet CM, Blahnik K, Green R, Farnham PJ. 2006. Comparison of sample preparation methods for ChIP-chip assays. BioTechniques. 41(5):577-580. https://doi.org/10.2144/000112268

5. 2007. Agilent Human, Mouse and Rat Genome CGH Microarrays, 244A and 105A . [Internet]. USA : Agilent Technologies, Inc . Available from: http://www.koreabiomics.com/avi/CGH%20array.pdf

6. Tavtigian Sea. 1996. The complete BRCA2 gene and mutations in chromosome 13qlinked kindreds. . Nature Genetics . 12 333-337.

7. Johnson NA, Hamoudi RA, Ichimura K, Liu L, Pearson DM, Collins VP, Du M. 2006. Application of array CGH on archival formalin-fixed paraffin-embedded tissues including small numbers of microdissected cells. Lab Invest. 86(9):968-978. https://doi.org/10.1038/labinvest.3700441