硫代磷酸寡核苷酸

為了試圖改變原生狀態DNA的化學特性，並因此克服在體內使用寡核苷酸所涉及的兩大挑戰，我們開發了幾種磷酸骨架變體，其中包括：1）透過質膜將寡核苷酸傳遞到細胞內部：1) 經由質膜傳遞到細胞內部，而質膜是一種脂質雙層膜，沒有轉運蛋白，對極性分子大多無法滲透；以及 2) 透過減少細胞外和細胞內核酸酶的降解來延長有效的分子壽命。

硫代磷酸鹽是最原始、也是目前使用最廣泛的骨架變異之一，當加入寡核苷酸時通常稱為 S-oligo（圖 1）。研究發現，硫代磷酸鹽可降低各種細胞外和細胞內核酸酶的活性¹，有助於減輕在體內使用寡核苷酸所面臨的第二大挑戰

。

圖 1. 磷酸二酯和硫代磷酸酯核苷酸內部連結。原生狀態 DNA 寡核苷酸中的糖分子透過磷酸鏈結（包括一個非橋接的氧（藍色箭頭）），而經硫化試劑修飾的寡核苷酸中的糖分子則透過硫代磷酸鏈結（包括一個非橋接的硫（紅色箭頭））。

這些特點使得硫代磷酸鹽能有效地製造出反義基因敲除的寡核苷酸，而反義基因敲除是早期的核酸治療技術之一²。硫代磷酸鹽寡核苷酸透過與目標 mRNA 進行雜交來下調基因表達，進而抑制 mRNA 成熟、使 RNase H 介導的轉錄本降解或阻斷翻譯³。

除了體內技術（例如反義技術）之外，硫代磷酸鹽現在也常與體外技術一起使用，原因類似，即防止核酸分解。舉例來說，下一代測序的適應子寡核苷酸通常會在一個 3'-terminal 的核苷酸間鏈接進行修飾，以防止文庫製備過程中使用的酵素降解⁴。

物理性质

虽然硫代磷酸酯核苷酸内连接对核酸酶具有抗性，但是引入过多的此类键会降低寡核苷酸的功能，尤其是反义寡核苷酸。這是因為合成過程中使用的硫化程序會產生立體的α-磷原子（圖 2），導致非對映異構體（長度為 n 的寡核苷酸有 2ⁿ-1 構型）。這些類型的立體異構體具有不同的功能特性，其中有些會對反意義產生負面影響。然而，非對映異構體的潛在負面影響可藉由適當加入修飾物降至最低。

圖 2. 一個核苷酸內鏈結上的立α-磷。隨機的 R 和 S 配置會產生非對映體。

納入指引

由於修改核苷酸間連結的效果通常無法預測³，因此設計有效的硫代磷酸酯寡核苷酸以抵抗降解通常是一個試驗和錯誤的過程（圖 3 為序列格式範例）。硫代磷酸鏈節不一定要出現在整個寡核苷酸中，但應考慮以下幾點：

        •  To resist exonucleases, the oligonucleotide should have phosphorothioate linkages near both the 5' and 3' ends
       - ；為了抵抗內切酶，寡核苷酸應該在整個序列中都有硫代磷酸鏈結

應該使用最少的納入次數--通常由實驗決定--來防止非對映混合物帶來的負面影響，包括：1）寡核苷酸的干擾
                     ：1) 對寡核苷酸的干擾：由較低的熔融溫度 (T_m) 帶來的目標雜交熱力學 - 由於某些構型的固體阻礙，增加了分子的剛性，以及 2) 非目標結合 - 過多的硫代磷酸酯連結會使寡核苷酸變得「黏稠」 - 可能會導致虛假的反义效果，因此增加細胞毒性的可能性。
 

                                        ACGTACGTACGTACGT            A*C*G*TACGTACGTACGTA*C*G*T

                   ；nbsp;                                                .nbsp;     磷酸二酯寡核苷酸                  nbsp;       硫代磷酸酯寡核苷酸

圖 3.具有相同序列的磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸的縮略序列格式示例。 硫代磷酸酯核苷酸內鏈結以星號標示。可以看出，該序列具有最少的併入次數，其設計目的是防止假定的外切酶。

此外，在要求使用經修飾的硫代磷酸酯寡核苷酸時，必須考慮到反應的計量會降低，進而導致最低產量低於純硫代磷酸酯寡核苷酸的產量（ 標準 DNA 合成）。nbsp;Standard DNA Synthesis and Custom DNA Oligos Modifications for minimum yield of phosphorothioate-only and modified-phosphorothioate oligonucleotides, respectively)。

純化

硫代磷酸酯寡核苷酸可透過 HPLC 進行純化，這對於它們是有益的，因為它們通常用於體內，因此必須具有盡可能高的均勻性，以避免細胞毒性效應、脫靶結合等。然而，由於硫代磷酸酯寡核苷酸較易形成次級結構，且由非對映混合物組成，因此 HPLC 的峰值會比磷酸二酯寡核苷酸的峰值寬一些 (Chromatography Profile Analysis of Phosphorothioate Oligonucleotides）。

結論

硫代磷酸酯可有效減少體內和體外技術所需的寡核苷酸的核酸分解。有幾種合成規模和純化方法可以滿足各種研究和應用的需求。

參考資料

1. Putney SD, Benkovic SJ, Schimmel PR. 1981. A DNA fragment with an alpha-phosphorothioate nucleotide at one end is asymmetrically blocked from digestion by exonuclease III and can be replicated in vivo.. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78(12):7350-7354. https://doi.org/10.1073/pnas.78.12.7350

2. Eckstein F. 2014. Phosphorothioates, Essential Components of Therapeutic Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 24(6):374-387. https://doi.org/10.1089/nat.2014.0506

3. Chan JH, Lim S, Wong WF. 2006. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES: FROM DESIGN TO THERAPEUTIC APPLICATION. Clin Exp Pharmacol Physiol. 33(5-6):533-540. https://doi.org/10.1111/j.1440-1681.2006.04403.x

4. Shin J, Ming G, Song H. 2014. Decoding neural transcriptomes and epigenomes via high-throughput sequencing. Nat Neurosci. 17(11):1463-1475. https://doi.org/10.1038/nn.3814