本文總結了反意義基因調控的幾種常見機制，更重要的是設計反意義寡核苷酸 (ASO) 時的注意事項。經過數十年的研究，目前並沒有硬性的設計規則；仍是嘗試與錯誤並存。不過，有一些準則需要遵循，應該可以讓這個過程更容易管理。
部分概述
設計協助
需要 ASO 設計協助或無法在線上訂購配置器中找到修改？我們的技術服務團隊可以提供協助。請發送請求至oligotechserv@sial.com。
調變機制
傳統的以 ASO 為基礎的基因調控 (通常是基因表達沉默或下調的同義詞，但也可用於改善基因表達，而且至少在一個特定案例中，它被證實會導致基因表達上調) 是以 mRNA 為目標，而且可以在細胞核或細胞質中進行。在細胞核（pre-mRNA 是目標）中，調節通常是透過重定向多聚腺苷酸化1、改變剪接事件2或裂解核苷酸鍵3來發揮作用，所有這些都是在 mRNA 成熟過程中發生的（圖 1）。在細胞質中 (成熟的 mRNA 是目標)，調變通常是透過沒有裂解的轉譯改變4或裂解3起作用，這兩種情況都發生在轉譯之前或轉譯過程中 (圖 2)。
圖 1.核仁中基於 ASO 的基因調節機制。就哺乳動物而言，核內的 gDNA 會轉錄為 pre-mRNA。核內的外源 ASO 會雜交 A) 到 pre-mRNA 上最 3'-most 的多聚腺苷酸化信號，並阻斷此位點上的多聚腺苷酸化，從而將其重定向到上游的另一個位點，這會上調基因的表達1 B) 到剪接位點，從而阻止剪接體的正常組裝，這會導致外元跳躍，因而改善疾病基因的表達2（許多人認為這不是真正的 ASO，這些寡核苷酸通常被稱為剪接轉換寡核苷酸）。sup>2（很多人認為這不是真正的 ASO，這些通常被稱為剪接切換寡核苷酸 [SSO]，或者更一般地說，steric blocking oligonucleotides [SBO]）C）一個外顯子或內含子（在本例中是一個內含子），從而導致 RNase H 的裂解3。在大多數情況下，雖然有顯著的上調、沉默或改變，但未受影響的前mRNA很可能會發生一些加工，接著成熟的mRNA會輸出到細胞質中。S = 多聚腺苷酸化信號序列（雖然這裡只顯示了一個，但每個轉錄本可能不止一個）。
圖 2.細胞質中基於 ASO 的基因調控機制。在哺乳類動物的例子中，核內的 gDNA 會 1) 轉錄成 pre-mRNA；2) 處理 pre-mRNA（加入 5「 cap 和 3」 poly[A] 尾）和剪接（移除內含子）以產生成熟的 mRNA；3) 成熟的 mRNA 會輸出到細胞質中。外源 ASO 與細胞質中的成熟 mRNA 進行雜交，並透過以下方式沉默（下調）基因表達：A) 翻譯改變，在本例中是透過破壞核糖體在 5' cap 處的組合來抑制翻譯4。sup>4（通常不被認為是真正的 ASO，這是一般 SBO 的例子）或 B）被 RNase H（特別是人類中的 RNase H1）3裂解。在大多數情況下，儘管受到顯著下調，翻譯仍會發生。
ASO通過Watson-Crick碱基配对與目標mRNA進行識別和雜交。能導致目標 mRNA 被 RNase H（無論是在核內或胞質內3）裂解的 ASO，在研究和治療上被廣泛研究，因此在調節機制上也是最容易理解的。RNase H（特別是人類中的 RNase H1）利用鎂離子作為輔助因子，透過水解核苷酸間（磷酸二酯）鍵5來裂解 mRNA:DNA 異質複合體中的 mRNA 鏈。在裂解之後，ASO 保持完整，而以前的 scissile 鍵現在是游離的 3「- 羥基和 5」- 磷酸基團，分別在降解的 mRNA 的 5「 和 3」 片段上。
設計考量
原則上，基因沉默應該像在目標 mRNA 中選擇一個序列一樣簡單；從供應商處訂購互補的、Watson-Crick-base-pairing ASO；將其導入所研究的系統（體外或體內）；以及透過相關的報告器觀察預期的效果。
杂交位点
根据 Watson-Crick 碱基配对规则，ASO 应该与目标 mRNA 序列的任何区域杂交。然而，mRNA 折疊成次級甚至是三級結構，可能會阻礙 ASO 的雜交。因此，應選擇 mRNA 的非折疊區域作為雜交位點。有一些濕實驗室方法，例如 RNase H 圖譜，對於預測可進入的位點6很有用，但一個好的開始是嘗試預測 RNA 折疊演算法，例如 標準修飾產品 將探討（表 1）。
ASO 的三個區域會受到修飾（核苷酸內部連結、糖和碱基），在後續的所有章節中，修飾會依據其主要效果分類，即使有幾種修飾具有多於一種效果，例如。例如，修飾 X 主要效果：提高結合親和力；次要效果：降低免疫刺激的有害影響 (本文的重點仍將放在主要效果上).
。硫代磷酸酯。 這種修飾是被視為第一代的少數修飾之一。PS-ASO 對核酸酶具有抗性，因此與全原生 DNA ASOs9 相比，具有較長的血漿半衰期。此外，它們保留了負性骨架電荷，這有助於 PS-ASO 進入細胞11。
然而，PS-ASO 並非完全不受核酸酶的影響，與目標 mRNA 的雜交程度也較低（請參閱結合親和性部分），而且必須持續大量施用才能維持調節作用11。此外，PS 在體內會與蛋白質互動，因此會導致負面副作用，包括免疫系統活性11.
甲基 RNA. 這種修飾是少數被認為是第二代的修飾。當在 ASO 中與 PS 結合時，2'-OMe-RNA 已被發現改善了單獨使用 PS 的好處（即增加耐核酸酶性、血漿半衰期和組織吸收11）。
甲氧基乙基 RNA。2「-Me-RNA 的一種衍生物，2」-O-甲氧基乙基 (2'-MOE) 近年來已經廣受歡迎，因為它已被包含在幾種已核准的藥物中23。
氟 RNA。用氟取代 RNA 中的 2′-羥基，可大幅提高其熔融溫度、化學穩定性和對核酸酶的耐受性。
免疫刺激
細菌 DNA 包含缺乏甲基化的 CpG（胞嘧啶-磷酸二酯鍵-關氨酸）二核苷酸的頻率遠高於脊椎動物 DNA。這主要是因為 CpG 二核苷酸在脊椎動物基因組中所佔的比例偏低，而且其中 80% 的二核苷酸都標示有甲基13。 由於細菌中的 CpG 基元會引發 B 細胞、NK 細胞、單體細胞和細胞因子的活化，而脊椎動物的 CpG 基元則不會，這可能至少是免疫系統辨識細菌感染的方式之一13。含有未甲基化 CpG（CpsG：胞嘧啶-硫代磷酸鍵-關氨酸的作用更強14）基序的 ASO 會以類似於細菌 DNA 的方式刺激免疫系統，這可能是早期反義研究中一些報告效果的原因。
為了避免免疫刺激，如果可能的話，設計缺乏 CpG / CpsG 基元的 ASO，或至少設計缺乏下列延伸基元的 ASO，因為延伸基元會產生最強的免疫反應14：
- 嘌呤-嘌呤-CpG-嘧啶-嘧啶
考慮到由於靶位點選擇序列的互補性，這可能難以避免，下一個最佳步驟是用 5'-甲基胞嘧啶（表 2），這已經證明可以顯著降低免疫刺激15。
序列長度
最佳長度通常為 12 到 28 個字元6。短於 12 個位元組的序列會增加脫靶雜交的機率，而長於 25 個位元組的序列則會降低細胞吸收的機率6.
自我互補性
應檢查 ASO 的次級結構和寡核苷酸二聚體的形成，因為其中任何一個都可能干擾與目標位點序列的雜交。如果可能，請將 ASO 設計成具有最弱的次級結構，並且不會形成二聚體。我們的寡核苷酸序列計算機 OligoEvaluator™ 可以快速確定這些自形成結構。
G-Quartet 結構
包含兩個或兩個以上 C 或 G 核苷酸延伸的 ASO 能夠形成不尋常的結構，這些結構可能會產生不良的、脫靶的效果。最常見且研究得最多的是 G 碱基的延伸，這會導致 G 四分體16的形成。這些四元組已經證實會與蛋白質結合，包括轉錄因子17，這些蛋白質可能會模仿並因此干擾反意義活性。
為了避免形成這些四元組，如果可能的話，請設計缺乏這些 polyG 片段的 ASO。同樣地，鑑於這可能不可行，下一個最好的步驟是以 7-deaza-dG 取代鳥嘌呤（表 3），這會阻斷四元組的形成18。
Functional Motifs
PS-ASO 實驗的統計分析發現下列動機組：
- CCAC
- TCCC
- ACTC
- GCCA<
- CTCT
與增強的反意義效率相關，而這些基元：
- GGGG
- ACTG
- AAA
- TAA
降低反义活性19。研究發現 RNase H 的活性與序列無關20；因此，我們相信增強基元會透過 GC Watson-Crick 碱基配對的優勢，增加 mRNA:ASO 異質雙工體的熱力學穩定性。
結合親和力
正如前面所討論的，在目標 mRNA 中找出一個沒有褶皺的位點以及確保 ASO 沒有有害的自補充性是非常重要的。然而，僅僅考慮這些因素還不足以確保正確的雜交。
第三代 ASO 改性不僅具有核酸酶抗性，還能改善結合親和力。鎖定核酸 (表 4)，以其受限的環狀結構，對於改善 ASO 結合親和力和有效性特別有用（相較於原生 DNA，每次加入單體的熔解溫度變化在 +3 到 +11 °C 之間21）。
The Construct
為了讓大家對 ASO 序列有更深入的了解，這裡提供了幾種已核准或正在臨床試驗中的反智藥（通常是進行反智研究的主要目的）的例子。這些藥物都是反智議時所有理想成果的範例 (或在臨床試驗中的藥物可望成為這些成果的範例)：良好的設計、可用的傳輸機制以及有效的調節。這些結果對研究實驗的成功也至關重要（我們的 ASO 適用於體外和體內的動物 RUO [僅供研究使用]）。
第一代。 1998 年，Fomivirsen（品牌名 Vitravene）是第一種獲得核准的反智藥物。巨細胞病毒視網膜炎 (CMV) 1998 年，Fomivirsen（品牌名 Vitravene）成為第一種獲得核准的反意義藥物，用於治療包括愛滋病患者在內的免疫受損患者。該藥物透過 玻璃體內注射給藥。具有所有 PS 核苷酸內部連結的 21mer ASO 序列如下：
- G*C*G*T*T*T*G*C*T*C*T*T*C*T*T*C*T*T*G*C*G
○ *=PS
它通過抑制 CMV 基因 UL12322 的轉錄 mRNA 的翻譯而起作用。由於治療 HIV HAART（高活性抗逆轉錄病毒療法）的發展使 CMV 病例減少了 75% ，因此導致銷量不佳，最終從市場上撤銷。
由於純 PS 的 ASO 不能完全不受核酸酶的影響、與目標 mRNA 的雜交能力降低、必須持續大量給藥以維持調節，而且會與蛋白質互作，可能會導致負面副作用11，因此第一代的構建物在研發管道中基本上已被拋棄。
第二代。 2013 年，Mipomersen（品牌名 Kynamro®）成為第二個獲准的反智藥物。它用於治療遺傳性高膽固醇血症家族性高膽固醇血症。該藥物以皮下注射方式給藥 。具有所有 PS 核苷酸內部連結的 20mer ASO 序列如下：
- G*mC*mC*mU*mC*A*G*T*mC*T*G*mC*T*T*mC*G*mC*A*mC*mC 。
○ Underline = 2'-O-MOE-RNA (MOE is 2-methoxyethyl)
○ m=甲基，即。e.5-Me-dC & 5-Me-U
○ * = PS
並透過抑制脂蛋白 B-100 mRNA 的轉譯23而發揮作用。存在嚴重 肝臟損傷的風險，因此該藥物必須成為風險管理計劃的一部分。
第二代反意分子（如 Mipomersen）採用 5-10-5 間隙構24。這可以從上面的序列看出：5「和3」翼的5個碱基（用抗核酸酶/增強結合親和力的糖修飾）和10個標準脫氧核糖核苷酸（無糖修飾）的中央間隙允許RNase H結合11。
在這種特殊情況下，翅膀由 2「-O-MOE-RNA （MOE 是 2-甲氧基乙基）組成，這是 2」-O-methyl RNA 修饰的變異。
第三代。 截至 2017 年，Miravirsen (SPC3649) 已進入第二階段臨床試驗25。它正在作為治療 皮下注射給藥。具有所有 PS 核苷酸內部連結的 15mer ASO 序列如下26：
- C*C*A*T*T*G*T*C*A*C*A*C*T*C*C
○ Underline = LNA
○ * = PS
與人類 miRNA miR-122 進行雜交。這可防止 miR-122 將 argonaute 帶到 HCV RNA 的 5'-UTR 區域，而它通常會與此區域結合，因此可防止核酸酶降解25。
儘管 Miravirsen 並非傳統的 ASO，因為它以 miRNA 為靶點，因此只能間接導致 mRNA 的降解，但它是含有 LNA 的第三代構建物的最佳範例之一，因此也包括在此。
目標檢查
最終的非修飾 ASO 序列應通過 BLAST 搜索，以確保任何非目標雜交（最好沒有）不會干擾反義活性或導致不可接受的毒性。
品質考量
對於體內動物實驗，我們建議使用ASO。動物實驗時，我們建議 ASO 採用鹽交換法進行 in-vivo 級純化（取代來自& phosphoramidite合成化學 中的有毒銨離子換成生理鈉離子）、內毒測試（確保熱原低於可接受的上限）和過濾（將污染的CFU數量降至可接受的上限以下）。我們的 iScale Oligos™ 產品是用於體內專案的較大量材料，可訂購這種純化和所有這些附加服務。
遞送& 毒性
雖然超出了本文的範圍，但有幾篇優秀的評論文章討論了各種遞送機制以及潛在的毒性11,27,28,29,30。
結論
當您設計了想要在實驗中嘗試的 ASO 時，我們已經準備好為您合成它 (我們的 ASO 適用於體外和體內的動物 RUO [僅供研究使用]）。如果需要額外的協助，尤其是關於生產非標準修飾的 ASO 的可行性，請發送請求至 oligotechserv@sial.com.
。參考資料
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