分析微陣列實驗中用於標記 DNA 的螢光染料

Dr. Jens Sobek, Catharine Aquino, Dr. Ralph Schlapbach

Functional Genomics Center Zurich, Zurich, Switzerland

Cy3 和 Cy5 是常用於微陣列分析的螢光染料。這兩種染料具有良好的特性，包括相對較高的螢光量子產率和最小的光譜重疊，使它們適用於多重檢測應用。

我們的研究目的是在陣列寡核苷酸的檢測中，用（1）更穩定且（2）在微陣列實驗中能產生更高螢光信號的染料來取代 Cy5 染料。在這項研究中，我們開發了一個模型系統，讓我們可以研究雜交到玻片表面的寡核苷酸-染料結合物的螢光和穩定性，而不需要費力、費時的樣品製備。我們只點選幾個寡核苷酸，並將單一染料標記的互補寡核苷酸雜交到每片玻片上，從而降低了實驗的複雜性。在此，我們提出初步結果，比較既有的藍色吲哚菁染料 Cy5、DY-647 和 Alexa Fluor^® 647，以及有潛力的候選 Atto 633 和 Atto 647N。完整的研究結果將於其他地方發表。¹

實驗細節

實驗細節材料

本研究使用了三種 71-mer 的寡核苷酸 (Operon, Cologne, Germany)，它們有一個共同的 13-mer 結合區域。共同的 13-mer 區域位於寡核苷酸的近端 3′端 (71prox)、靠近中心 (71cent) 或遠端 5′端 (71dist)。13-mer寡核苷酸-染料結合物（5′-dye-TGCCTGAAGCTAT; ON-Dye）包含序列（ON® 647) 合成。除 Cy5 外，所有染料都是在寡核苷酸合成後的單獨反應中，經由氨基己基連結劑以 NHS 酯的形式納入。納入 Cy5 時，使用 Glen Research (Sterling, VA, USA) 提供的磷酸酰胺構建區塊。使用 Milli-Q^® Synthesis A10 純化系統對水進行去離子過濾。所有寡核苷酸均經 HPLC 純化。氯化鈉（分子生物學級）、HEPES（N-[2-羥乙基]哌嗪-N`-[2-乙磺酸]，>99.5%)、檸檬酸三鈉(>99%)、鹽酸(p.a.)和十二烷基硫酸鈉(>98%)來自 Sigma (Buchs, Switzerland)。

陣列製作

使用 sciFLEXARRAYER (Scienion, Berlin, Germany) 和 Piezorray™ (Perkin Elmer, Downers Grove, IL, USA) 非接觸式點膠儀器製作微陣列。將三種 71-mer 寡核苷酸 (71prox, 71cent, and 71dist)在 3× 生理鹽水-檸檬酸鈉緩衝液 (SSC) 中的稀釋系列 (20, 10, 5, and 2.5 μM)，以 15 次重複（每點 1.5 nL）的方式點在環氧矽烷塗層的玻片上 (Scienion, Berlin, Germany)。²

雜交

清洗、阻斷、雜交和乾燥步驟在自動雜交站 (HS4800, Tecan, Salzburg, Austria) 中進行，允許 12 張玻片同時進行雜交。13-mer 寡核苷酸-染料結合物的 50 nM 溶液於 30 °C 下在 HEPES/SSC/SDS 中與 4 張重複的玻片雜交 2 小時。雜交後，在 23 °C、非緊縮條件下依序以 2× SSC / 0.2% SDS、0.2 × SSC / 0.2% SDS 及 0.2× SSC 洗淨玻片。然後在雜交站中用氮氣烘乾玻片，以避免與空氣接觸。乾燥後，將玻片快速移至充滿氮氣的塑膠袋中，以減少與空氣接觸的時間至 10-15 秒。放入袋中後，玻片用空白玻璃片蓋住，以保護微陣列表面的染料，避免被空氣中的臭氧和其他氧化劑降解。

染料穩定性的判定

為了判定染料的穩定性，玻片在氮氣環境下掃描了 12 次。使用附近環境測量站（蘇黎世 Stampfenbachplatz）提供的資料來估計大氣中的臭氧濃度。³ 我們發現我們實驗室的臭氧濃度約為 Stampfenbachplatz 測得濃度的 75%。⁴

掃描與資料分析

所有玻片都在相同條件下使用 Tecan LS400 雷射掃描器進行掃描。陣列由玻璃蓋保護，並將雜交面朝下進行掃描。掃描器的焦點設定在玻片的下側，並透過玻璃測量螢光。使用 Array-Pro^® Analyzer 4.5.1 軟體 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA) 評估掃描結果。

吸光和螢光光譜

吸光和螢光光譜是在 1× SSC 中使用 Tecan Safire2™ 光譜儀拍攝的。在 600 nm 處激發螢光，並在溶液表面進行檢測（頂部讀取模式）。

圖 1. 吲哚羰花青染料和羰基多胺染料的化學結構。

結果與討論

評估的染料分子結構如圖 1所示。經典的吲哚菁染料 Cy5、DY-647 和 Alexa Fluor 647 的核心發色體結構完全相同。化合物的不同之處在於烷基的種類和位置，以及存在的磺酸基團的數量，這會影響核心的整體電荷（三種染料分別為+1、-1 和 -3）。Atto 633 和 Atto 647N 屬於硼二胺染料，兩者的電荷均為 +1。

所有五種染料的吸光率和螢光光譜如 圖 2所示。對光譜的分析將在即將出版的刊物中發表。

圖 2. 寡核苷酸染料結合物 (ON-Dye) 的吸收 (A) 和螢光 (B) 光譜。

螢光強度

圖 3 顯示與 ON-Atto 647N 進行雜交的玻片的典型影像。在與三個 71-mer 寡核苷酸探針雜交後，使用四個複製玻片上的 15 個複製點測量了每個寡核苷酸-染料結合物的相對螢光強度，並將每個結合物的數據取平均值（圖 4）。

螢光數據分析顯示了一個不均勻的模式。寡核苷酸-染料結合物 ON-Cy5 和 ON-Atto 647N 與 ；71dist （圖 4A）和 71cent （圖 4B）。發現 ON-Cy5 和 ON-Atto 647N 的最大強度比其他三種共結物高約 50%。此外，五種 ON-染料的信號強度有很大的差異，尤其是與 71dist雜交時，這些差異與染料電荷相關。帶正電荷的染料（Cy5、Atto 633 和 Atto 647N）比 DY-647（電荷-1）和 Alexa Fluor 647（電荷-3）產生更強烈的螢光信號。當雜交到 71prox (圖 4C)時，所有五種寡核苷酸-染料結合物都有相當的螢光強度。

為了研究染料電荷對信號的影響，在雜交步驟中使用5×SSC/0.1% SDS緩衝液在23 °C進行了第二組雜交。在這些較寬鬆的條件下，特定染料標示的 13-mer 與三種 71-mer 進行雜交後，並未觀察到螢光強度的差異 (資料未顯示)。螢光強度與染料電荷相關，Cy5 和 Atto 647N 結合物再次產生最高的強度，而帶負電荷的染料 DY-647 和 Alexa Fluor 647 染料的強度則低達 60%。

資料顯示，30 °C時螢光強度的差異是由於寡核苷酸雜交物與染料負電荷互動所造成的不穩定性。Waggoner等人在胸腺嘧啶的C-5位上多重標記了Cy3的27-mer寡核苷酸、⁴ 在以螢光素和曙紅為骨架標記的24-mer寡核苷酸、⁵ 或連接到非聚合體的2-位上的羅丹明中觀察到了這種雜交失穩。⁶ 然而，據我們所知，由於附著在寡核苷酸一端的標記染料所引起的不穩定性互動，以前從未被報導過。

我們的結果顯示，對於使用短寡核苷酸的應用，帶正電荷的標記染料（例如、Cy5、Atto 647N、Atto 633），以避免觀察到的不穩定性效應。

圖 3. 使用共聚焦顯微鏡測量的螢光影像。點對點距離為 500 μM。

圖 4. 寡核苷酸-染料結合物（ON-Dye）與固定在環氧硅烷塗層表面的互補 71-mer 寡核苷酸（A，71prox；B，71cent；或 C，71dist）雜交後的螢光強度。

染料穩定性的研究

許多吸收長波長的標記染料，特別是包括 Cy5、DY-647 和 Alexa Fluor 647 在內的氰基染料，其限制在於固有的低光穩定性和大氣臭氧的強化降解。⁷ 在玻片掃描過程中，高臭氧濃度導致染料快速降解，可能會造成無效數據。在蘇黎世，冬季和夏季測得的臭氧濃度分別為 10-30 ppb 和 10-75+ ppb。 在最高的臭氧濃度下，未加保護的玻片暴露幾分鐘就會導致吲哚菁染料明顯降解。

為了比較染料的穩定性，我們進行了兩組實驗。首先，為了確定光穩定性，雜交玻片被掃描了 12 次。由於光降解會隨著臭氧濃度的增加而強烈增加，因此我們在氮氣下使用保護蓋玻璃掃描玻片（請參閱 實驗細節）。其次，另一批雜交玻片在實驗室環境條件下暗處儲存，並分別暴露在含有 ~15 ppb 濃度臭氧的空氣中 30 分鐘和 30 ppb 150 分鐘。

對玻片掃描 12 次後，信號衰減在 3% 到 9% 之間，其中 Atto 647N 的衰減程度最小（圖 5）。Cy5 和 Atto 633 的信號強度下降最明顯。

圖 5. 輻照染料降解。雜交玻片掃描 12 次。第一次掃描與最後一次掃描的螢光強度比值圖。為排除臭氧的影響，切片在氮氣下進行掃描。

將氰基染料暴露於臭氧中會對染料表面的螢光強度產生巨大影響（圖 6）。ON-Cy5 在相對較低的臭氧濃度 (15 ppb) 下曝露 30 分鐘，螢光強度會損失 30%。在這些條件下，磺化染料 (ON-DY-647 和 ON-Alexa Fluor 647) 較為穩定。在較高的空氣臭氧濃度 (30 ppb) 及長時間曝露 (150 分鐘) 下，信號強度分別降低 75%（Alexa Fluor 647）、79%（DY-647）及 89%（Cy5）。Atto 染料僅顯示出輕微的螢光強度損失，Atto 647N 減少了 9%，Atto 633 則少於 1%。我們甚至觀察到以碳化氫胺為基礎的 Atto 染料的螢光強度在初期有所增加。

圖 6. 大氣臭氧對螢光強度的影響。將已雜交的玻片在黑暗中曝露於濃度為 A) 15 ppb (30 μg/m3) 的臭氧中 30 分鐘，及 B) 25 ppb (50 μg/m3) 的臭氧中 150 分鐘。強度於暴露前後測量。

結論

我們測量了五種寡核苷酸-染料結合物與固定在微陣列玻璃表面的三種 71-mer 寡核苷酸雜交後的相對螢光強度和穩定性。我們觀察到螢光強度與染料的整體電荷相關，帶負電的染料會產生較低的螢光強度。我們將此歸因於染料對混合體的不穩定性。當選擇染料用於需要低熔點寡核苷酸的應用時，這一信息可能很有價值。

所有測試的染料都很穩定，在大氣臭氧的保護下，可以在適當的激發波長下重複掃描。Atto 633 和 Atto 647N 在暴露於臭氧時會出現輕微的螢光信號損失，從這方面來看，將它們用作微陣列應用中的標記染料是最理想的。我們知道，這項研究的結果並未顯示這些染料可如何成功地用於氨基烯丙基取代核苷酸的二次 DNA 標籤反應及後續雜交。進一步的工作正在進行中。

參考資料

1. Sobek JA, Aquino C, Schlapbach R. To be published.

2. Sobek J, Aquino C, Schlapbach R. 2007. Quality Considerations and Selection of Surface Chemistry for Glass-Based DNA, Peptide, Antibody, Carbohydrate, and Small Molecule Microarrays.17-31. https://doi.org/10.1007/978-1-59745-304-2_2

3. Available from: http://www.stadtzuerich.ch/internet/ugz/home/fachbereiche/luftqualitaet/ messwerte/tagesverlauf

4. Randolph J. 1997. Stability, specificity and fluorescence brightness of multiply-labeled fluorescent DNA probes. 25(14):2923-2929. https://doi.org/10.1093/nar/25.14.2923

5. Ozaki H, McLaughlin LW. 1992. The estimation of distances between specific backbone-labeled sites in DNA using fluorescence resonance energy transfer. Nucl Acids Res. 20(19):5205-5214. https://doi.org/10.1093/nar/20.19.5205

6. Aurup H, Tuschl T, Benseler F, Ludwig J, Eckstein F. 1994. Oligonucleotide duplexes containing 2?-amino-2?-deoxycytidines: thermal stability and chemical reactivity. Nucl Acids Res. 22(1):20-24. https://doi.org/10.1093/nar/22.1.20

7. Fare TL, Coffey EM, Dai H, He YD, Kessler DA, Kilian KA, Koch JE, LeProust E, Marton MJ, Meyer MR, et al. 2003. Effects of Atmospheric Ozone on Microarray Data Quality. Anal. Chem.. 75(17):4672-4675. https://doi.org/10.1021/ac034241b