以 CRISPR 為基礎的基因活化

CRISPR 用於表觀遺傳編輯 - dCas9

表觀遺傳編輯是一種工具，利用工程分子在基因組中的特定位點修改 DNA 或組蛋白。這種策略需要精確的靶向，而精確的靶向是透過使用核酸酶缺陷的 Cas9 (dCas9) 來完成的。

p300-dCas9誘導的靶向組蛋白乙酰化

組蛋白乙酰化由組蛋白乙酰轉換酶（HATs）進行，在調節染色質動態和轉錄調節中扮演著基本的角色。p300/CBP 是一種組蛋白乙酰轉換酶（HAT），其功能對於調節哺乳類動物細胞中的基因表達至關重要。p300 HAT domain (1284-1673) 具有催化活性，可與核酸酶融合進行靶向表觀遺傳組編輯。

我們開發了一種利用 CRISPR 進行高效靶向組蛋白乙酰化的方法。我們證實了 gRNA 可以成功地引導融合了 p300 HAT 催化域的 dCas9 來增加組蛋白乙酰化的水平和內源基因的表達。這種研究特定基因位點組蛋白乙醯化功能的策略，在研究和治療上有極大的應用潛力。

dCas9-p300 CRISPR 基因激活劑

dCas9-p300 CRISPR 基因激活劑系統是基於 dCas9 與人類 E1A 相關蛋白 p300 的催化組蛋白乙酰化轉移酶（HAT）核心結構域的融合。Gersbach 實驗室（杜克大學）已獨立驗證此方法可在相對於轉錄起始位點 (TSS) 的近端和遠端位置活化基因。與 dCas9-VP64 或其他類似的基因活化基元相比，dCas9-p300 組蛋白乙酰化方法代表了一種獨特的作用機制。雖然 VP64 等啟動域有助於招募轉錄複合物到啟動子區域，但它們會受到基因的表觀遺傳狀態的支配，並且取決於其他轉錄蛋白的可用性。相反地，p300 組蛋白乙酰基轉移蛋白透過釋放 DNA 的異染色質狀態來打開轉錄高速公路，讓內源細胞機器能持續且強壯地表達基因。

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以上是表達 dCas9p300 融合蛋白的質粒的地圖。此質粒同時也表達來自與 dCas9p300 相同轉錄本的 GFP，可輕鬆監測在您的目標細胞中的傳送與表達。dCas9p300 質粒可以與客製化的 U6-gRNA 質粒共同轉染，以在轉錄起始位點或其他調控位置附近進行靶向活化。我們提供一個 Oct4 控制質粒 (CRISPR17-1EA)，可用來幫助您的實驗室建立 dCas9p300 方法。此 Oct4 控制質粒已在 HEK293 細胞中證實有效（如下圖）。我們建議您在嘗試任何新的細胞類型時，同時在 HEK293 細胞中測試 Oct4 控制。

OCT4（POU5F1）是最難被激活的靶點之一

八聚體結合TF 4（Oct4，POU5F1）是維持幹細胞多能性的關鍵轉錄因子（TF）。它在恢復細胞多能性的過程中也扮演著重要的角色。在已分化的細胞中，OCT4 的表達受到嚴格的沉默。

p300-dCas9激活內源OCT4

p300的HAT結構域（1284-1673）融合到dCas9（D10A，H840A）生成p300-dCas9。設計了九個 gRNA 來靶向 OCT4。與對照的 HEK293 細胞相比，測試的 9 種 gRNA 中的 6 種與 p300-dCas9 一起會導致 2 倍或更高的 OCT4 轉錄物水平。

參考資料

1. Hilton IB, D'Ippolito AM, Vockley CM, Thakore PI, Crawford GE, Reddy TE, Gersbach CA. 2015. Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers. Nat Biotechnol. 33(5):510-517. https://doi.org/10.1038/nbt.3199

2. Ji Q, Fischer AL, Brown CR, Eastlund ER, Dvash T, Zhong B, Gerber MA, Lyons I, Knight SW, Kreader CA. 2014. Engineered zinc-finger transcription factors activate OCT4 (POU5F1), SOX2, KLF4, c-MYC (MYC) and miR302/367. 42(10):6158-6167. https://doi.org/10.1093/nar/gku243