間充質幹細胞(Mesenchymal stem cells, MSCs) 具有多系分化能力，可產生多種間充質表型，如骨細胞(骨)、脂肪細胞(脂肪)和軟骨細胞(軟骨)。幹細胞療法為下一代醫療突破帶來了無限的希望。在這方面，多能祖細胞（如 hMSCs）因其分化為各種細胞類型的能力及其免疫調節特性，已引起臨床高度關注。 用於擴增 hMSCs 的細胞培養基的成分是開發異體細胞治療產品的重要關鍵。到目前為止，幾乎所有在臨床試驗中的這類產品都需要在生長培養基中添加血清進行擴增，其中最顯著的是胎牛血清 (FBS)。FBS 中含有未知傳染性試劑的風險也是一大隱憂。有些研究顯示，病人可能會對異種蛋白產生免疫反應，而這些異種蛋白可能會在培養過程中從 FBS 傳染給 hMSC。因此，FBS 的替代品正在研究中。
PLTMax® 人血小板裂解液 是一種富含生長因子的補充劑，是人間充質幹細胞 (MSC) 擴增過程中胎牛血清 (FBS) 的優越替代品。PLTMax® 人血小板裂解物已被用於有效培殖來自人類、小鼠、兔和豬等物種的間充質幹細胞，並已用於全球多項I期臨床試驗。
在此，我們研究了PLTMax® hPL是否可用於在正常組織培養瓶和生物反應器培養中的微載體上擴增hMSCs，而不會影響細胞的特性和功能。我們認為 PLTMax® hPL 可以替代 FBS 用於間充質幹細胞培養。
方法
人間充質幹細胞在人血小板裂解液中擴展
人間充質幹細胞來自骨髓（SCC034），並按照其他地方描述的方法進行培養。培養基包括α-MEM (M8042)，補充10% MSC合格的FBS或5% PLTMax® 補充劑(SCM141)、2 mM l-谷氨酰胺(A8185)、1×α-MEM® 補充劑(SCM141)。EmbryoMax® 青黴素-鏈黴素溶液 (TMS-AB2)、8 ng/mL 人重組基本成纖維母細胞生長因子 (F0291) 和 2 U/mL 肝素 (H3149)。選擇膠原I型塗層微載體（CLS3786）在旋轉瓶（CLS3561）或Mobius® CellReady一次性使用生物反應器中擴展hMCs。
人間充質干細胞分化
用Accutase (A6964)處理間充質干細胞，並使其脫離其微載體，在含PLTMax® 或FBS的培養基中生長，然後將它們以2.1 × 104 cells/cm2 for inducing adipogenesis and a density of 4.2 × 103 cells/cm2 for inducing osteogenesis, which is described elsewhere.
FACS 間充質幹細胞標記分析
我們將細胞顆粒重懸於含 2% BSA (A9576) 的 alpha-MEM 中，使細胞濃度達到 5 × 105 細胞/毫升。我們的詳細方案已在其他地方說明。簡而言之，細胞在Guava®easyCyte 8HT流式細胞計系統 上讀取，原始資料匯入FlowJo® 程式(Treestar)進行分析。
A) PLTMax® hPL ； ； ；B) FBS
人間充質幹細胞來自骨髓（SCC034），並按照其他地方描述的方法進行培養。培養基包括α-MEM (M8042)，補充10% MSC合格的FBS或5% PLTMax® 補充劑(SCM141)、2 mM l-谷氨酰胺(A8185)、1×α-MEM® 補充劑(SCM141)。EmbryoMax® 青黴素-鏈黴素溶液 (TMS-AB2)、8 ng/mL 人重組基本成纖維母細胞生長因子 (F0291) 和 2 U/mL 肝素 (H3149)。選擇膠原I型塗層微載體（CLS3786）在旋轉瓶（CLS3561）或Mobius® CellReady一次性使用生物反應器中擴展hMCs。
用Accutase (A6964)處理間充質干細胞，並使其脫離其微載體，在含PLTMax® 或FBS的培養基中生長，然後將它們以2.1 × 104 cells/cm2 for inducing adipogenesis and a density of 4.2 × 103 cells/cm2 for inducing osteogenesis, which is described elsewhere.
我們將細胞顆粒重懸於含 2% BSA (A9576) 的 alpha-MEM 中，使細胞濃度達到 5 × 105 細胞/毫升。我們的詳細方案已在其他地方說明。簡而言之，細胞在Guava®easyCyte 8HT流式細胞計系統 上讀取，原始資料匯入FlowJo® 程式(Treestar)進行分析。
Figure 1.在含有5% PLTMax®或10% FBS的培養基中生長的P4骨髓間充質幹細胞的相位亮圖. 這兩種條件下的間充質幹細胞具有與未分化多能間充質幹細胞相關的典型纖維母細胞樣紡錘形態。
圖 2.PLTMax® hPL 在組織培養瓶和旋轉瓶中支持 hMSCs 比 DMEM + FBS 更優異的擴展。 A)與 DMEM + 10 % FBS 相比，在αMEM 輔以 5 % PLTMax® hPL 或 10 % FBS 培養的 hMSCs 在 T150 燒瓶中經過 4 次傳代後的生長，或 B）在重複 125 mL Spinner flask 中或 7 天，顯示在αMEM + PLTMax® hPL 中生長增強。
圖 3.在Mobius®生物反應器中使用PLTMax®(hPL) vs. FBS擴增的hMSCs具有相同的生物標記表達和分化潛力。A）將來自兩種成人骨髓捐贈（hMSC1 或 hMSC3）的 hMSCs 在 DMEM+5 % PLTMax® 或 DMEM+10 %FBS 的 Mobius® CellReady 3L 生物反應器中擴展。B) hMSC1 細胞在第 14 天以流式細胞計法 (柱狀圖) 或 RT-PCR (插圖) 進行分析。與 FBS 相比，使用 PLTMax® 擴增的 hMSCs 檢測到相同的表面標記水平。在檢測的 46 個 hMSC 相關基因中，96% 在兩種條件下有高度相關性。）按照各自的分化方案，第 14 天收穫的細胞在脂肪細胞染色油紅（Oil Red）和骨細胞染色茜素紅（Alizarin Red）方面呈陽性。
圖 4.<在5% PLTMax®或10%胎牛血清(FBS)培養基中培養的hMSCs保留了其幹細胞特性，細胞表面抗原表達陽性：CD73、CD90和CD105陰性：CD11b、CD34 和 CD45。
若要繼續閱讀，請登入或建立帳戶。
還沒有帳戶？