從人類神經幹細胞株衍生功能性少突細胞祖細胞 (OPC)

Christine Chen, Michael Moeller, Anna Abai, Nick Asbrock and Vi Chu

Merck, Bioscience Division, Temecula, CA, USA

人類神經幹細胞（hNSCs）因其在神經退行性疾病和脊柱損傷中的治療潛力而受到深入研究。根據微環境和生長刺激，這些細胞可以進行神經發育，取代受損細胞。在中樞神經系統中，單靠神經生成不足以修復神經元損傷。功能性神經元需要髓鞘的保護，而髓鞘是由少突胶质细胞合成的，這樣才能成功傳送長距離的動作電位。

一般而言，hNSCs 在體外產生的少突胶质细胞數量低且不一致。為了開發一個少突胶质细胞培养模型系統，我們測試了三個神經幹細胞系分化成少突胶质祖細胞（OPCs）的能力。其中兩個細胞系對分化體系作出反應，該體系包括小分子和生長因子、PDGF、NT3、甲狀腺激素 (T3) 和 FGF2。透過免疫螢光染色測量多種少突胶质標誌物，兩種細胞株的 OPC 人數都增加了 30% 到 50% ：NG2、O4、Sox10 和 GalC。在無細胞有絲分裂原的條件下，這些 OPC 可進一步分化為成熟的少突胶质细胞。我們的資料顯示，這些細胞至少在三次傳代中保持穩定的 OPC 特性，並在分化後表達多種少突胶质细胞標記。使用共培養系統，我們顯示這些人類 OPC 在原代大鼠神經元培養物中發展成成熟的少突胶质细胞，在軸突周圍產生 MBP。

人類神經幹細胞培養

。

兩種人類永生化神經幹細胞株ReNcell™ VM (SCC008)和ReNcell™ CX (SCC007)與ENStem-A™人類ESC衍生神經祖細胞株(SCR055)一起使用。神經幹細胞以單層培養，使用ReNcell維持培養基(SCM005)新鮮補充20 ng/mL FGF-2或ENStem™-A擴展培養基(SCM004)新鮮補充20 ng/mL FGF-2和2 mM谷氨酰胺。ReNcell 株系培養在塗有 20 μg/mL laminin (L2020) 的培養瓶上，而 hESC-NPC 細胞則培養在塗有 Matrigel 的培養瓶上。所有細胞均保持在 5% CO₂、37 °C 的組織培養箱中，使用 Accutase^® 溶液 (A6964) 進行酶切，並以 1X10⁵/cm² 密度播種，直到達到 70-80% 的融合度。

ligodendrocyte分化和成熟

ligodendrocyte祖細胞特性分析

10⁴ cells/cm² OPCs were plated on 0.1% poly-L-ornithine (P4957) 和 10 μg/mL laminin (L2020) 包被的 Millicell^® EZ SLIDES (PEZGS0416) 或 T25 烧瓶上，培養過夜後轉換到不含生長因子的培養基。在用 2% 多聚甲醛固定或裂解提取 RNA 前，讓少突胶质细胞成熟 2 到 3 周。

增殖的 OPC 用特异性早期少突胶质细胞标记物的抗体表征，包括抗 Sox10 (AB5727, 1:200), 抗NG2 (AB5320, 1:200), 抗 Olig-2 (AB9610, 1:100), 和抗 O4 (MAB345, 1：50），而分化兩週的少突胶质细胞则以中晚期少突胶质细胞标记物抗体表征，包括抗 GalC（MAB342，1:200）、抗PLP-1/DM20（MAB388，1:100）、抗 MBP（05-675，1:25）、抗 MOG（MAB5680，1:25）、抗 CNPase（1:100）和抗 RIP（1:25）。星形細胞用抗-GFAP（MAB3402，1:250）標記，神經元用抗-bIII 小管蛋白（MAB1637，1:100）或抗-MAP2（MAB3418，1:200）標記。

體外髓鞘化測試

12 mm蓋玻片用1N HCl (H1758)酸處理過夜，再用Milli-Q^® H₂O (MILLIQ)沖洗，然後高壓滅菌。蓋玻片在室溫下塗上 0.1% 聚-L-赖氨酸 (P8920) 1 小時後晾乾，再以無菌蒸餾水洗淨。將 1 x 10⁵ 原代 E19 大鼠海馬神經元 (R886N-10) 鍍在 4 孔板的每一孔中的 Poly-L-lysine 鍍膜蓋玻片上，並以含 10%熱滅活馬血清的 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)培養。培養 24 到 48 小時後，按照製造商的規程用 1 μg pCAG-GFP 質粒轉染細胞。轉染後 24 小時，約 10-20% 的原代神經元呈現 GFP 陽性。轉染四天後，將 2 x 10⁴ 人類 OPCs 接種到平板上，神經元培養基更換為人類 OPC 自發分化培養基 (SCM106)。人類 OPCs 和大鼠原代神經元共培養在 37 °C、5% CO₂ 組織培養箱中放置 21 天，每 2 至 3 天更換一次培養基。

結果

測試了三種神經祖細胞株進行 OPC 富集。其中，ENStem-A ESC 衍生的 NPC 株系和永生化人胎 NSC 株系 (ReNcell VM) 在 OEM 培養中含有大量 A2B5- 和 GalC 陽性細胞。

圖1 顯示了在原始培養基（親源）或少突胶质细胞富集培養基（OEM）中培養的人類NSCs的定量和代表性圖像。ENStem- A細胞（圖1A和B）在OEM培養中顯示O2A祖先標記A2B5中度增加，而中間少突胶质细胞標記GalC增加3倍。相反，在 OEM 中培養的 ReNcell VM 細胞（圖 1C 和 D）的 A2B5 表達增加超過 6 倍，GalC 表達增加不到 2 倍。這說明，即使經過相同的富集程序，每個 NSC 系對小分子和生長因子的反應都不同。

圖 1. 人類神經幹細胞系衍生的 OPC。(A)ENStem-A或(C)ReNcell VM衍生培養物中A2B5-或GalC-陽性細胞在標準培養基（親本）或少突胶质细胞富集培养基（OEM）中的定量測量。(B)和(D)顯示(A)和(C)的代表性圖像。影像以 20X 物鏡拍攝。A2B5-Parental (B, D, upper left); A2B5-OEM (B, D, upper right)；Gal C-Parental (B, D, 左下方); Gal-C-OEM (B, D, 右下方)。

為了研究OPCs是否能穩定地維持在少突胶质细胞富集培养基中，我們通過測量倍增時間來監測細胞增殖率。在至少7周的培養過程中，細胞每48小時翻一番（圖2A），雙極形態表明這些細胞處於神經祖細胞/少突細胞祖細胞的分化階段。

圖 2. 人類 OPCs 在解凍後 24 小時(A)及培養一週後(B)的增殖明視野影像。人類 OPCs 每 48 小時增加一倍 (C)。

接下來，我們通過免疫螢光染色檢查了OPC細胞在第3期和第5期之間的蛋白質表達。我們觀察到大量細胞表達 Olig2 (92%, 圖 3A), Sox10 (81%, 圖 3B), O4 (82%, 圖 3C).)、O4 (82%，圖 3C)、NG2 (64%，圖 3D)和 GalC (80%，圖 3E)。自發分化 2 周後，細胞變成 50% 到 70% 的 MAP2- 或 bIII-tubulin 陽性神經元 (圖 4)，以及少於 5% 的 GFAP 陽性星形細胞 (圖 4)。30%到50%的細胞顯示出強大的中後期少突胶质细胞標記MBP、PLP-1、MOG、RIP、GalC和NG2的表達（圖4）。

圖 3. 少突胶质细胞祖细胞特征。人類 OPCs 表達早期少突細胞標誌 Olig2、Sox10、O4、NG2 和 GalC。寡突細胞祖細胞以 10⁴ cells/cm² 複製到塗有 poly-L-ornithine 和 laminin 的 24 孔板上。

圖 4. 成熟少突胶质细胞的特征。經過 2 週的自發分化後，人類 OPCs 會產生約 30% 的成熟少突細胞 (MBP、MOG、PLP、RLP、RIP) 和 ~50% 的神經元 (Tubulin、MAP2)。將人類 OPCs 以 10⁴ cells/cm² 複製到塗有 poly-L-ornithine 和 laminin 的 24 孔板上，並以人類 OPC Expansion Complete Media 複製。接種後 24 小時，使用人類 OPC 自發分化完全培養基 (Human OPC Spontaneous Differentiation Complete Media) 進行培養基交替，以啟動自發分化。

從胚胎海馬中分離出來的大鼠原代神經元大多是具有單軸突和多樹突組成的獨特形態的金字塔神經元。為了方便鑑定大鼠原代神經元，我們以瞬間轉染的方式引入綠色螢光蛋白 (GFP)。10%-20%的細胞成功轉染，GFP的表達在觀察期間是穩定的。將人類 ES 細胞衍生的 OPCs 以 1:5 的比例加入到大鼠原代神經元培養物中。開始共生培養三週後，我們用免疫螢光染色法分析髓鞘化的相對程度。髓鞘基本蛋白 (MBP) 是髓鞘的主要成分。在沒有人類 OPCs 的情況下，大鼠原代神經元培養物幾乎沒有 MBP 染色（圖 5A）。相反，在含有 GFP 標記軸突和人類 OPCs 的共培養物中，觀察到顯著的 MBP 染色（圖 5B）。MBP 的表達與細胞核共定位，提供了人類 OPCs 表達 MBP 的證據。該數據表明，在成熟或發育中的軸突存在的情況下，人類 ES 細胞衍生的 OPCs 可進一步成熟為功能性少突細胞，能夠產生髓鞘保護軸突。

圖 5. 體外髓鞘化試驗。人類 ES 細胞衍生的 OPC (Human Nuclei+) 與大鼠原代神經元 (A、B、C) 共同培養時，會使神經元 (MBP+) 髓化。

結論

我們已經開發出一種穩定的幹細胞系，可以在培養中維持高比例的少突胶质祖細胞，而且在自發分化後有可能產生功能性的、產生髓鞘的少突胶质細胞。這些細胞也可用於篩選促進或抑制人類 OPC 存活及分化的分子。我們目前的工作是找出可增加 OPC 分化的分子。這種方便、可靠的少突胶质细胞来源可能有助於多發性硬化症等疾病的神經退化治療研究。

常見問題

我應該把細胞解凍到哪個組織培養瓶上？

應解凍一小瓶細胞，並將其覆在塗有 Matrigel 的 T25 燒瓶上。不建議解凍至更大的容量瓶。

電池是在哪個通道提供的？

細胞在第 3 階段儲存，可擴展兩次。細胞使用不應超過第 6 週期。

我可以通過細胞多少次？

細胞可傳代兩次。解凍時，細胞處於第 4 階段。再經過兩次傳代，細胞就達到 6 代。細胞不應擴展至 6 通道以上。

我應該在什麼匯合度時通過細胞？

細胞應在達到 80% 匯合度時進行傳代。不建議在細胞達到 100% 匯合時進行傳代。

最佳分割比率是多少？

最佳播種密度為 2 到 4 x 10⁴ / cm²。這相當於在適當包被的 T25 燒瓶上接種 500,000 個細胞，或 1:3 至 1:5 的分割。

我可以凍結我的細胞嗎？

不，我們不建議凍結電池。個別使用者凍結的電池效能無法保證。

我可以用我的媒體來代替嗎？

人類 OPC 擴展培養基專為我們的人類 OPC 最佳化。其他培養基尚未經過測試。如果使用其他培養基，則應由使用者對細胞進行廣泛的表徵，以確保細胞保留正確的表型和染色特徵。

我可以使用人類 OPC 擴展或分化培養基套件來擴展、培養和分化我從其他供應商取得或自己分離出來的少突胶质细胞嗎？

<這些培養基專為人類 OPCs 最佳化。其他類型的細胞尚未經過測試。我們不認為從其他來源獲得的細胞或直接從大腦組織分離的細胞在培養基系統中會有類似的表現。

我可以使用自己的生長因子進行分化嗎？

除試劑盒中提供的生長因子外，尚未測試其他生長因子。如果用戶考慮使用其他生長因子，建議他們使用所提供的培養基套件作為陽性對照，以比較其他生長因子和細胞因子對人類 OPC 擴展和分化的影響。

我可以使用不同的 ECM 來塗層嗎？

除試劑盒中列出的 ECM 外，尚未測試其他 ECM。如果使用者考慮使用其他 ECM，建議使用試劑盒中列出的試劑和 ECM 作為陽性對照，以比較其他 ECM 對人類 OPC 擴展和分化的影響。