誘導多能幹細胞分化協議

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什麼是誘導多能幹細胞？

成人體細胞可重編成誘導多能幹細胞 (iPSCs) 具有過度表達的關鍵重編基因 (OCT4、KLF4、SOX2、cMYC、NANOG 和 LIN28)。人類 iPSCs 具有獨特的分化能力，可以分化成人體的任何細胞類型，包括：

• 外胚層： 神經元、星形細胞、少突細胞、視網膜上皮細胞 (RPE)、表皮細胞、毛髮和角質形成細胞。
• 內胚層： 肝細胞、胰臟 β-islet Cell、腸上皮細胞、肺泡細胞。
• 中胚層： 造血細胞、內皮細胞、心肌細胞、平滑肌細胞、骨骼肌細胞、腎細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和骨細胞。

圖 1. iPSC 途徑

iPSC系列

我們提供大量用於控制人類iPSCs細胞轉歸的細胞培養基、補充劑、生物活性小分子和生長因子。下表重點列出用於將人類 iPSCs 分化成不同細胞系的最廣泛使用的方案、培養基和表征抗體。

分化細胞類型	媒體與補充品	表徵抗體	參考文獻
神經幹細胞	DMEM/F12, Glutamine, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, Compound E, Human LIF, Noggin, bFGF, EGF 訂購完整的培養基	Nestin, PAX6, OTX2	透過雙重抑制 SMAD 訊號1
皮层神經元	DMEM/F12, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, ；CHIR99021, Compound E, Noggin, bFGF, EGF Order Complete Media	MAP2, TBR1, CTIP2, ；VGLUT1	人類多能幹細胞定向分化為大腦皮層神經元和神經網路2
多巴胺能神經元	DMEM/F12, 谷氨酰胺, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, CHIR99021, SHH<, FGF8, BDNF, GDNF, TGFβ3, cAMP Order Complete Media	TH, TUJ-1, LMX1A, FOXA2, NURR1	Nestin, TUJ-1, ChAT, ；Islet1, Hb9, Hoxa2	人誘發多能幹細胞定向分化產生活躍的運動神經元4
Astrocyte	DMEM/F12, B27, 非必需氨基酸, FBS, bFGF, CNTF, BMP4, Activin A, Heregulin 1β. IGF-1	GFAP, TUJ-1, CD44	在定義的條件下從人類多能幹細胞高效生成星形細胞5
ligodendrocyte	DMEM/F12, 谷氨酰胺, Neurobasal Media, N2, B27, SB431542, ；CHIR99021, Compound E, all-trans retinoic acid (ATRA), SHH, SAG, PDGF,&nnbsp;IGF-I, NT3。, T3<, cAMP	PAX6, OLIG2, NKX2.2, O4, SOX10, MBP, MAP2	誘導多能幹細胞從原發性進行性多發性硬化症患者高效生成髓鞘少突細胞6
心肌細胞	RPMI 1640, B27, rH-albumin, L-ascorbic acid 2-phosphate, CHIR99021, Wnt-C59	TNNT2, α-SMA, α-Actinin, ；vWF, MLC2A, MLC2V	化學定義產生的人類心肌細胞7
骨骼肌	IMDM, FBS, Glutamine, Penicillin-Streptomycin, 2- 巯基乙醇<亞油酸, 硫酸鐵, Y-27632, bFGF	CD13, CD31, CD56, CD44, CD45, CD49b, CD146, MyHC
血管內皮/平滑肌	DMEM/F12, Neurobasal Media, N2, B27, CHIR99021, BIO, Y-27632, BMP4, VEGF, Forskolin, PDGF-BB, Activin A, Heparin	CD31, CD144, vWF, I-CAM1, SMA, MyHC, VECAD, PECAM	從人類多能幹細胞中產生血管內皮細胞和平滑肌細胞9
肝細胞	RPMI 1640, B27, Activin A, RPMI 1640, BMP4, bFGF。, HGF, Oncostatin M	FOXA2, SOX17, GATA4, HNF4-α, AFP, ALB	從誘導多能幹細胞高效生成人類肝細胞樣細胞10
胰島β細胞	DMEM/F12, IMDM, 牛血清白蛋白, N2, B27, ITS, BMP4, Activin A, FGF7, Noggin, bFGF,&nnbsp;EGF, Exendin-4, 全反式維A酸(ATRA)	PDX1, FOXA2, SOX9, HNF1β, c-peptide, Insulin, Somatostatin	人類ES細胞和iPS細胞高效分化為成熟的胰島素分泌細胞11
肺部	DMEM/F12, B27, N2, 抗壞血酸, 牛血清白蛋白<, Y-27632, 牛血清白蛋白SB431542, IWP2, CHIR99021, BMP4, bFGF, Activin A, FGF-10, FGF7,  EGF, 全反式視黃酸 (ATRA)	FOXA2, SOX2, NKX2.1, p63	人類多能幹細胞高效生成肺和氣道上皮細胞12

iPSC的常見問題

1.幹細胞分化的挑戰何在，尤其是iPSCs？

• 效率和可重複性：儘管已取得進展，但指導 iPSCs 分化為特定細胞類型仍可能不一致。提高分化協議的一致性和可靠性對其在研究和臨床環境中的廣泛應用至關重要。
• 分化細胞群的異质性：即使是成功的分化，也往往會產生成熟度、功能和純度各異的異質細胞群。控制和最小化這種異質性對於為下游應用獲得均勻和功能性的細胞群是非常重要的：實現成熟和功能性 iPSC 衍生細胞具有挑戰性。與原生細胞相比，許多細胞類型可能表現出不成熟的表型或功能缺陷，因此改進分化協議對於加強臨床轉化至關重要。
• 擴展和自動化：我們需要可擴充和自動化的分化平台，以生產大量一致且高品質的細胞產品供臨床應用。開發符合法規標準的穩健製程對於商業化至關重要。

2. 科學家如何改善幹細胞分化的結果？

• 優化培養條件：微調培養基成分，包括生長因子、細胞因子、小分子和補充劑，可顯著影響幹細胞的分化效率和特異性。以系統化實驗和回饋為基礎，迭代優化培養條件，對實現可重現和穩健的分化結果至關重要。
• 使用定義和化學定義的培養基：從複雜且未定義的培養系統轉換到定義且化學定義的培養基配方，可降低變異性並加強對分化過程的控制。定義的培養基配方只包含特性良好的成分，有助於標準化、可擴展性和符合法規要求，特別是在臨床應用方面。
• 使用仿生培養系統：利用生物仿真培養系統（例如三維支架、片上器官平台和共培養系統）來模擬細胞的生理微環境，可增強體外分化模型的相關性和真實性。這些系統提供空間提示、細胞之間的互動和機械刺激，可以更好地再現組織結構和功能，促進更多生理相關的分化結果。

您還可以整合多組學方法、利用單細胞分析、採用基因組編輯進行精確控制，以及實施機器學習和資料整合，以改善分化結果。

3.您認為研究人員在 iPSC分化協議上犯的最大錯誤是什麼？

雖然研究人員繼續在幹細胞分化協議方面取得重大進展，但幾個常見的錯誤可能妨礙實驗的成功和可重複性，例如：

• 缺乏優化：未能針對特定的細胞類型和實驗條件徹底優化分化方案可能會導致結果多變或不一致。研究人員可能會忽略有系統地測試各種培養條件的重要性，包括生長因子、細胞活素、基底特性和培養時間，以找出可實現穩定性和可重複性分化的最佳條件。
• 表徵不足：分化細胞群的表徵不足，可能會模糊所製造細胞的異質性、成熟度和功能性。研究人員可能會忽略進行全面表型和功能分析的必要性，包括免疫染色、流式細胞計、基因表達分析和功能測試，以驗證已分化細胞的特性和品質：忽略或未充分處理已分化細胞群內的異質性，可能會影響實驗結果的可靠性和可詮釋性。研究人員可能會忽略純化或富集特定細胞子集的重要性，例如使用螢光激活細胞分選 (FACS) 或磁性細胞分選，以獲得均勻的細胞群來進行下游分析或應用。
• 可重複性差：忽略實驗程序、試劑製備和細胞處理規程的記錄和標準化，可能會妨礙不同實驗室或實驗之間的可重複性。研究人員可能會忽視保存詳細記錄、遵循標準化作業程序，以及與科學界分享協議和試劑以促進可重複性和透明度的重要性
• 忽略品質控制措施：低估品質控制措施的重要性，例如在整個分化過程中監控細胞活力、純度和無菌性，可能會導致實驗假象或污染問題。研究人員可能會忽略定期進行細胞系鑑定、支原體測試和內毒素篩檢的必要性，以確保細胞培養物的完整性和安全性。
• 過度依賴 2D 培養系統：僅依賴傳統的 2D 培養系統，而不考慮這些平台在重現複雜組織結構和微環境提示方面的限制，可能會產生次佳的分化結果。研究人員可能會忽略採用 3D 培養系統、類器官模型或微流體裝置的優點，這些裝置可更好地模擬 體內組織生理學，並提高分化效率和功能：不充分的資料分析和詮釋可能會導致複雜的實驗結果被誤解或過度簡化。研究人員可能會忽略應用適當的統計方法、資料視覺化技術和計算工具來分析高維資料集，並從實驗中擷取有意義的洞察力的重要性。

4.科技如何幫助幹細胞分化方案和結果？

技術在推進幹細胞分化協議和改善這些實驗結果的幾個方面，扮演了關鍵的角色：

1. 高通量篩選（HTS）：配備機器人、液體處理系統和成像裝置的自動化平台，可對大型化合物庫或培養條件進行高通量篩選，以找出促進或抑制幹細胞分化的因子。HTS加速了新型小分子、生長因子或培養基配方的發現，以提高分化效率和特異性。
2. Omics技術：基因組學、轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學的進展，可在分子層面上對幹細胞及其分化後代進行全面剖析。整合多組學資料，可深入瞭解與不同分化階段相關的調控網路、訊號通路和關鍵生物標誌物，從而引導分化方案的最佳化，並找出調節細胞命運決定的新目標。
3. 基因組編輯工具：精確的基因組編輯技術，如CRISPR-Cas9，可針對性地操控基因表達、表觀遺傳學修訂和涉及幹細胞分化的訊號通路。基因組編輯可讓研究人員設計出具有所需表型特徵的幹細胞，提高分化效率，並在體外建立遺傳疾病模型，促進疾病機制的研究和個人化療法的開發。

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參考資料

1. Chambers SM, Fasano CA, Papapetrou EP, Tomishima M, Sadelain M, Studer L. 2009. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27(3):275-280. https://doi.org/10.1038/nbt.1529

2. Shi Y, Kirwan P, Livesey FJ. 2012. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7(10):1836-1846. https://doi.org/10.1038/nprot.2012.116

3. Ma L, Liu Y, Zhang S. 2011. Directed Differentiation of Dopamine Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.411-418. https://doi.org/10.1007/978-1-61779-201-4_30

4. Karumbayaram S, Novitch BG, Patterson M, Umbach JA, Richter L, Lindgren A, Conway AE, Clark AT, Goldman SA, Plath K, et al. 2009. Directed Differentiation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells Generates Active Motor Neurons. 27(4):806-811. https://doi.org/10.1002/stem.31

5. Shaltouki A, Peng J, Liu Q, Rao MS, Zeng X. 2013. Efficient Generation of Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells in Defined Conditions. 31(5):941-952. https://doi.org/10.1002/stem.1334

6. Douvaras P, Wang J, Zimmer M, Hanchuk S, O’Bara M, Sadiq S, Sim F, Goldman J, Fossati V. 2014. Efficient Generation of Myelinating Oligodendrocytes from Primary Progressive Multiple Sclerosis Patients by Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 3(2):250-259. https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2014.06.012

7. Burridge PW, Matsa E, Shukla P, Lin ZC, Churko JM, Ebert AD, Lan F, Diecke S, Huber B, Mordwinkin NM, et al. 2014. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nat Methods. 11(8):855-860. https://doi.org/10.1038/nmeth.2999

8. Maffioletti SM, Gerli MFM, Ragazzi M, Dastidar S, Benedetti S, Loperfido M, VandenDriessche T, Chuah MK, Tedesco FS. 2015. Efficient derivation and inducible differentiation of expandable skeletal myogenic cells from human ES and patient-specific iPS cells. Nat Protoc. 10(7):941-958. https://doi.org/10.1038/nprot.2015.057

9. Patsch C, Challet-Meylan L, Thoma EC, Urich E, Heckel T, O’Sullivan JF, Grainger SJ, Kapp FG, Sun L, Christensen K, et al. 2015. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nat Cell Biol. 17(8):994-1003. https://doi.org/10.1038/ncb3205

10. Si-Tayeb K, Noto FK, Nagaoka M, Li J, Battle MA, Duris C, North PE, Dalton S, Duncan SA. 2010. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51(1):297-305. https://doi.org/10.1002/hep.23354

11. Zhang D, Jiang W, Liu M, Sui X, Yin X, Chen S, Shi Y, Deng H. 2009. Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells. Cell Res. 19(4):429-438. https://doi.org/10.1038/cr.2009.28

12. Huang SXL, Islam MN, O'Neill J, Hu Z, Yang Y, Chen Y, Mumau M, Green MD, Vunjak-Novakovic G, Bhattacharya J, et al. 2014. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32(1):84-91. https://doi.org/10.1038/nbt.2754