Sepharose Fast Flow：具有良好解析度和易於擴展的純化技術

• 使用 Sepharose Fast Flow 純化蛋白質。
• 使用 Sepharose Fast Flow 進行需要良好解析度的擷取或中間純化步驟（流量高達 300 cm/h）。
• 如果強離子交換器（用Q、S或SP替代）不能提供所需的選擇性，則使用弱離子交換器，如DEAE、CM或ANX Sepharose Fast Flow。
• 在ÄKTAdesign、FPLC System和HPLC等系統或使用蠕動泵的系統上運行Sepharose Fast Flow色譜柱。 附錄4 提供如何選擇最適合ÄKTAdesign系統的指引。

Sepharose Fast Flow 媒介基於由 6% 瓊脂糖製成的 90 μm 顆粒基質，高度交聯的化學和物理穩定性。ANX Sepharose 4 Fast Flow (high sub) 以 4% 琼脂糖為基質，形成一種在分離大分子（如甲狀腺球蛋白 (M_r = 650 000)）時仍能保持高結合能力的培養基，特別適合在總結合能力變得具有經濟意義的情況下進行大規模生產。

Sepharose Fast Flow 基質被一系列離子交換基團（Q、DEAE、ANX、SP 和 CM）取代，提供了測試和使用不同選擇性的機會（見 第 1 章 以瞭解強離子交換器和弱離子交換器的說明）。

含有強離子交換基團（Q 和 SP）的離子交換器可在寬廣的 pH 值範圍內保持其電荷，從而為每種應用選擇最合適的 pH 值。

含有弱離子交換基團（DEAE、CM 和 ANX）的離子交換器可提供其他選擇性，但 pH 值工作範圍較窄。Figure 55 illustrates how the selectivity of Sepharose Fast Flow media changes according to the anion exchange group.

儘管離子強度或pH發生變化，但粒子尺寸和床層體積保持穩定，以確保在高流速下進行快速分離，並具有良好的解析度。從HiTrap Q FF（1 mL，預包Q Sepharose Fast Flow）等色譜柱到FineLINE等大型色譜柱，各種方法都可以輕鬆擴展。Sepharose Fast Flow 介質的性能有據可查，從實驗室到中試規模再到生產的順利轉移也有許多實例。

圖 55. 在一系列陰離子交換HiTrap色譜柱上分離conalbumin (I)、a-lactalbumin (II)和大豆胰蛋白酶抑制劑(III)，顯示出不同陰離子交換組別在選擇性上的差異。

淨化選項

圖 56. Sepharose Fast Flow 媒介具有一系列的選擇性，可預先包裝在 HiTrap 和 HiPrep 柱中，也可包裝在介質包中。

產品	每柱或每毫升培養基的結合能力	建議工作流量	最大流量*		工作pH範圍**	最大工作背壓*** (MPa/psi) 1 MPa=10 bar
HiTrap Q FF, 1 mL	3 mg (thyroglobulin, Mr 669 000) 120 mg (HSA, Mr 68 000) 110 mg (a–lactalbumin,& 120 mg (HSA, Mr 68 000) 110 mg (a-lactalbumin, & nbsp;Mr 14 300)	最高 1 mL/min <	4 mL/min	2-12	0.3/43
HiTrap Q FF, 5 mL	15 mg (thyroglobulin, Mr 669 000) 600 mg (HSA, Mr 68 000) 600 mg (HSA, Mr 68 000) 550 mg (a-lactalbumin, Mr 14 300)	最高5 mL/min	20 mL/min	2-12	0.3/43
HiPrep 16/10 Q FF, 20 mL	60 mg (thyroglobulin, ；Mr 669 000) 2400 mg (HSA, Mr 68 000) 2200 mg (a-alpha)。 2200 mg (a-lactalbumin, Mr 14 300)	2-10 mL/min	10 mL/min	2-12	0.15/22
Q Sepharose Fast Flow	3 mg/mL (thyroglobulin, ；Mr 669 000)  120 mg/mL (HSA, Mr ；68 000) 110 mg/mL, (a-lactalbumin, Mr 14 300)	50-400 cm/h	750 cm/h	2-12	0.3/43
強陽離子交換器
HiTrap SP FF, 1 mL	50毫克（牛COHb, Mr 69 000） r 160 000) 70 mg (ribonuclease A, Mr ；13 700)	最高1 mL/min	4 mL/min	4-13	0.3/43
HiTrap SP FF, 5 mL	250 mg (bovine COHb, ；Mr 69 000) 250 mg (人IgG, Mr 160 000)  350 mg (核糖核酸酶A, Mr 13 700)	最高5 mL/min	20 mL/min	4-13	0.3/43
HiPrep 16/10 SP FF, 20 mL	1000 mg (bovine COHb, Mr 69 000) 1000 mg (human IgG, Mr ；160 000)  1400 mg (核糖核酸酶A, Mr 13 700)	2-10 mL/min	10 mL/min	4-13	0.15/22
SP Sepharose Fast Flow	50 mg/mL（牛 COHb， Mr 69 000）  50 mg/mL（人IgG， Mr< 50 mg/mL (human IgG, Mr 160 000)  70 mg/mL (ribonuclease A, Mr 13 700)	50-400 cm/h	750 cm/h	4-13	0.3/43
弱負離子交換器
HiTrap DEAE FF, 1 mL	100 mg (a-lactalbumin, Mr 14 300)    110 mg (HSA, Mr 68 000) <	最高1 mL/min	4 mL/min	2-9	0.3/43
HiTrap DEAE FF, 5 mL	500 mg (a-lactalbumin, Mr 14 300)  550 mg (HSA, Mr 68 000)	最高5 mL/min ；	20 mL/min	2-9	0.3/43
HiPrep 16/10 DEAE FF, 20 mL	2000 mg (a-乳清蛋白, Mr 14 300)    r 68 000)	2-10 mL/min	10 mL/min	2-9	0.15/22
DEAE Sepharose Fast Flow	100 mg/mL  (a-lactalbumin, Mr 14 300) 110 mg/mL (HSA, ；Mr 68 000）	50-400 cm/h ；	750 cm/h	2-9	0.3/43
HiTrap ANX FF (high sub), 1 mL	43毫克(BSA, Mr 67 000) 5毫克(甲狀腺球蛋白, Mr 669 000)	最高1 mL/min ；	4 mL/min	2-9	0.3/43
HiTrap ANX FF (high sub), 5 mL	215 mg (BSA, Mr 67 000) 25 mg (thyroglobulin, Mr 669 000)	最高5 mL/min	20 mL/min	2-9	0。3/43
HiPrep 16/10 ANX FF (高次), 20 mL	860毫克（BSA, Mr 67 000） r 669 000)	2-10 mL/min	10 mL/min	2-9	0.15/22
ANX Sepharose 4 Fast Flow (high sub)	43毫克/毫升（BSA, Mr 67 000）       ；  5 mg/mL (thyroglobulin, Mr 669 000)	50-300 cm/h	400 cm/h	2-9	0.1/14
弱陽離子交換器
HiTrap CM FF, 1 mL	50 mg (ribonuclease A, Mr 13 700)	最高 1 mL/min<	4 mL/min	6-10	0.3/43
HiTrap CM FF, 5 mL	250 mg (ribonuclease A, Mr ；13 700)	最高5 mL/min	20 mL/min	6-10	0.3/43
HiPrep 16/10 CM FF, 20 mL	1000 mg (ribonuclease A, Mr 13 700)	2-10 mL/min	10 mL/min	6-10	0.15/22
CM Sepharose Fast Flow	50毫克/毫升介質（核糖核酸酶A， Mr	50-400 cm/h	750 cm/h	6-10	0.3/43

* 請參閱 Appendix 5 to convert linear flow (cm/hour) to volumetric flow rates (mL/min) and vice versa.
***工作 pH 值範圍是指介质按照預期或洗脫需要結合蛋白質，而不會造成長期不良影響的 pH 值區間。
***最大工作背壓是指介质開始壓縮的壓力。

• 使用預先包裝的 HiTrap 色譜柱（1 mL 或 5 mL）進行介質選擇、方法測試、群組分離、小規模純化、樣品濃縮或清理。
• 使用預先包裝的 HiPrep 色譜柱（20 mL）進行方法開發、組別分離、大規模純化、樣品濃縮或清理。串聯數支 HiPrep 色譜柱來增加結合能力。

用於柱填料

縱列	容量	床面高度
Tricorn 10/100	最高 8 mL	最高 10 cm
Tricorn 10/150	高達 12 mL	高達 15 cm
最高 16 mL	最高 20 cm
XK 16/20	高達 30 mL	高達 15 cm
XK 26/20	最高 80 mL	最高 15 cm
XK 26/40	最高 196 mL<	> 15 cm
XK 50/20	最高 274 mL	至 14 cm
XK 50/30	至 559 mL	至 28.5 cm

選擇 BPG 或 Chromaflow 等生產級色譜柱來處理較大的用量。

纯化示例

介质筛选

使用 1 mL HiTrap 色谱柱，可以在优化和放大之前快速方便地选择最适合分离的基质和带电基团。在圖57中，比較了同一樣品在相同條件下於三種不同介質上進行分離的洗脫圖譜，說明了改變電荷基團和粒度可導致的選擇性和解析度差異。

首先在強離子交換器（Q、S 或 SP）上進行探查，以便找到相關分子之間電荷差異最大的部分。

圖 57. 培養基探測：在 HiTrap CM Sepharose Fast Flow 1 mL、HiTrap SP Sepharose Fast Flow 1 mL 和 HiTrap SP XL 1 mL 上分離核糖核酸酶 A (I)、細胞色素 C (II) 和溶菌酶 (III)。

圖 58. 使用 HiPrep 16/10 DEAE Sepharose Fast Flow 膠柱作為擷取步驟，以濃縮 rPhosphatase 並去除大部分雜質。

放大

图 59显示了在预装了 Sepharose Fast Flow 介质的色谱柱上放大分离的简便性。從 1 mL HiTrap 膠柱開始，經過 20 倍的擴展，分離的重現性維持不變。

圖 59. 使用預先包裝的 Q Sepharose Fast Flow 色譜柱進行 5 倍和 20 倍放大。

圖 60. 在 DEAE Sepharose Fast Flow 上進行優化和放大。

優化pH值

當為分離選擇了最合適的介質後，可通過調整pH值等參數進一步優化條件。圖61展示了在使用CM Sepharose Fast Flow（HiPrep 16/10 CM FF）預先包被的色譜柱上增加pH值如何顯著提高模型蛋白混合物的解析度。

圖 61. 在 HiPrep 16/10 CM FF 上選擇分離標準蛋白質的最佳 pH 值。

樣品濃縮

在凝膠過濾前濃縮樣品以減少樣品體積，並促進快速、高解析度的尺寸分離是一項優勢。HiTrap 膠柱提供方便、即用的樣品濃縮解決方案。表 7 上的 第 89 頁舉例說明使用預先包裝了 Sepharose HP 媒介的 HiTrap 色譜柱從非常稀釋的起始材料中濃縮蛋白質時所獲得的高濃縮因子。

進行分離

有關選擇培養基、緩衝液、pH 值和離子強度條件以及方法優化的指引，請參閱

。nbsp;第 2 章。

• 正確的樣品和緩衝液製備對於達到最佳分離效果和避免色譜柱性能下降至關重要。樣品必須完全溶解，且不含可能干擾分離的顆粒或其他物質。請參考 Chapter 2 and Appendix 1 for recommendations and advice on sample preparation.
• 過濾緩衝液在包含所有鹽分和添加劑之後。使用高品質的水和化學品。使用 1 μm 或更小的過濾器過濾溶液。
• 使用負離子交換器（Q、DEAE 或 ANX）時，起始緩衝液的 pH 值應至少高於目標物質的 pI 值 0.5-1 個 pH 單位；使用陽離子交換器（SP、CM）時，起始緩衝液的 pH 值應至少低於目標物質的 pI 值 0.5-1 個 pH 單位。請參閱 附錄 2 以瞭解有關陰陽離子交換器的揮發性和非揮發性緩衝系統的建議。

對於電荷性質未知的樣品，請嘗試以下方法：

• 陰離子交換（Q）
  起始緩衝液：pH 8.0
  洗脱緩衝液：包含 1 M NaCl 的起始緩衝液，pH 8.0
• 陽離子交換 (SP)
  起始緩衝液：pH 6.0
  洗脱緩衝液：包含 1 M NaCl 的起始緩衝液，pH 6.0

如果使用強離子交換器（Q或SP）時的選擇性不令人滿意，請嘗試使用弱離子交換器（DEAE、ANX或CM）代替。

具有BufferPrep功能的ÄKTAdesign系統用戶可從pH值為8的陰離子交換色譜法或pH值為6的陽離子交換色譜法所推薦的緩衝液配方中選擇一種。

首次使用或長期儲存後

梯度洗脱分离

流量：1 mL/min (HiTrap 1 mL)、5 mL/min (HiTrap 5 mL)、5 mL/min (HiPrep 20 mL)，或以 150 cm/h 的流速進行 Sepharose Fast Flow 包裝在更大的色譜柱中。

1. 用5-10柱体积的起始缓冲液或直到基线、洗脱液pH值和电导率稳定为止对色谱柱进行平衡。
2. 使用5-10柱容量的起始緩衝液進行洗滌，或直到基線、洗出液pH值和電導率穩定，即所有未結合物質均已洗過柱為止。
3. 用 5 柱容量的 1 M NaCl（100%B）清洗，以洗脱任何剩余的离子结合物质。
4. 用 5-10 柱容量的起始缓冲液重新平衡，或直到洗脱液的 pH 值和电导率达到所需值。

分步洗脱分离

流量：1 mL/min (HiTrap 1 mL)、5 mL/min (HiTrap 5 mL)、5 mL/min (HiPrep 20 mL)，或以 150 cm/h 的流速進行 Sepharose Fast Flow 包裝在更大的色譜柱中。

1. 用5-10柱体积的起始缓冲液或直到基线、洗脱液pH值和电导率稳定为止对色谱柱进行平衡。
2. 用5-10柱容量的起始緩衝液洗滌，或直到基線、洗出液pH值和電導率穩定，即所有未結合物質均已洗過柱。
3. 用5柱容量的起始緩衝液+NaCl以選擇的離子強度洗滌。
4. 用 5 柱容量的高鹽溶液（起始緩衝液中的 1 M NaCl）清洗柱子，洗離任何剩餘的離子結合物質。
5. 重新平衡 5-10 柱容量的起始緩衝液或直到洗出液的 pH 值和電導率達到所需值。

• 在高鹽水洗和重新校正步驟中使用較高的流速，節省時間。
• 不要超過介質的最大推薦流量。
• 如果使用了離子洗滌劑，用 5 柱容量的蒸餾水洗柱，然後用 2 柱容量的 2 M NaCl 洗柱。用至少 10 柱体积的起始缓冲液重新校准，直到 UV 基线、洗脱液 pH 值和/或电导率稳定为止。乙醇等有機溶劑可用於去除非離子洗滌劑。選擇有機溶劑時，請檢查介質的化學穩定性，以確定合適的濃度。
• 請參閱 Chapter 2 以獲得最佳化分離的建議。
• 定期檢查色譜柱性能，確定色譜柱效率和峰對稱性。
• 請參閱 附錄 3。

清洗

正确制备样品和缓冲液，并在每次分离结束时进行高盐清洗（1 M NaCl），可使大多数色谱柱保持良好状态。然而，性能降低、流速緩慢、背壓增加或完全堵塞都表明介質需要使用更嚴格的程序進行清洗，以去除污染物。

建議在色譜柱清洗時顛倒流動方向，這樣污染物就不需要通過色譜柱的整個長度。每個清洗步驟所需的色谱柱容量和時間可能因污染程度而異。如果清除常見污染物的清潔步驟無法恢復色譜柱性能，請在嘗試其他清潔方法之前更換頂部過濾器（如可能）。更換過濾器時應小心，因為這可能會影響色谱柱填料並干擾性能。

以下程序應能滿足清除常見雜質的要求：

1. 用至少 2 個柱容量的 2 M NaCl 以 1 mL/min（HiTrap 1 mL）、5 mL/min（HiTrap 5 mL）、5 mL/min （HiPrep 20 mL）或 40 cm/h、接觸時間 1-2 小時的速度清洗填裝在較大柱中的 Sepharose Fast Flow。
2. 用至少 4 柱容量的 1 M NaOH（流量與步驟 1 相同）清洗。
3. 用至少 2 柱容量的 2 M NaCl（流量與步驟 1 相同）清洗。
4. 用至少 2 個柱容量的蒸餾水沖洗（流程與步驟 1 相同），直到 UV 基線和洗出液 pH 穩定為止。
5. 用至少 4 個柱容量的啟動緩衝液或儲存緩衝液沖洗（流程與步驟 1 相同），直到洗出液 pH 和電導率達到要求值。

要去除沉澱的蛋白質、脂質、疏水結合蛋白或脂蛋白，請參考 附錄 1。

媒體特性

組成：

• 磺丙基（SP）、羧甲基（CM）、季氨基（Q）或二乙基氨基乙基（DEAE）基團透過化學上穩定的醚鍵與高度交聯的 6% 瓊脂糖耦合。
• 二乙氨基丙基 (ANX) 基團透過化學穩定的醚鍵與高度交聯的 4% 瓊脂糖結合。

Product	Functional Group	pH穩定度*	Mean particle size
Q Sepharose Fast Flow	-CH2N+(CH3)3	長期：2-12 短期：1-14	90 μm
SP Sepharose Fast Flow	-CHCH2CH2SO3-	長期：4-13 短期：3-14	90 μm
DEAE Sepharose 快速流	-O-CH2CHOHCH2N+H(CH2CH3)2	長期：2-13 短期：1-14	90 μm
ANX Sepharose 4 Fast Flow	-OCH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+H(CH2CH3)2	長期：3-13 短期：2-14	90微米
CM Sepharose	-O-CH2COO-	長期：4-13 短期：2-14	90微米

* 長期 pH 穩定性指的是介質在長時間內保持穩定而不會對色譜性能產生不良副作用的 pH 區間。
短期 pH 穩定性指的是再生、原位清洗和消毒程序的 pH 區間。
所有範圍都是根據 Cytiva 的經驗和知識估計的。

化學穩定性

對於日常使用，Sepharose Fast Flow 介質在所有常見的水性緩衝液、1 M NaOH、變性劑（8 M 尿素、6 M 鹽酸胍）、添加劑（如非離子洗滌劑、70% 乙醇、1 M 乙酸和 30% 異丙醇）中都是穩定的。Sepharose Fast Flow 可用於有機溶劑，如二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、四氫呋喃、丙酮、氯仿、二氯甲烷、二氯乙烷和二氯乙烷/吡啶 (50:50) 以及極性溶劑和水/有機分離液。介質中的水可以被替代溶劑交換，而對基質的孔徑影響極小。

使用 SP 或 CM Sepharose Fast Flow 時避免使用陽離子洗滌劑。使用 Q、DEAE 或 ANX Sepharose Fast Flow 時避免使用陰離子洗滌劑。避免使用氧化劑。

儲存

色譜柱儲存時，先用 2 柱容量的蒸餾水洗，再用 2 柱容量的 20% 乙醇洗。在 SP Sepharose Fast Flow 的 20% 乙醇溶液中加入 0.2 M 乙酸鈉。對乙醇/水混合物進行徹底脫氣，並以低流速使用，避免對柱造成過大壓力。室溫儲存，或長期儲存於 +4 °C 至 +8°C。確保色谱柱密封良好，避免乾燥。如有可能，請使用製造商提供的儲存與運送裝置。將未使用的培養基存放於 20% 乙醇中，溫度為 +4 °C 至 +30 °C。請勿冷凍。

• 為避免填料柱中形成氣泡，在準備運行時，請確保柱和緩衝液處於相同溫度。