色譜柱包裝和製備
Cytiva的預包裝色譜柱將確保可重複的結果和最高的性能。
使用小型預包裝色谱柱進行培養基考察和方法優化，以提高方法開發的效率，例如 HiTrap IEX Selection Kit。
高效的色谱柱包裝對 IEX 分離至關重要，尤其是在使用梯度洗脫時。填料不佳的色谱柱會造成流動不均勻、色帶擴寬和分辨力下降。如果需要柱填料，以下指南适用于所有操作规模：
- 对于高结合能力的介质，使用短而宽的色谱柱（通常为 5-15 cm 床高）进行快速纯化，即使线性流速较低。本手冊提供了每種培養基的結合能力，並隨產品說明書提供。估計結合所需樣品所需的培養基量，然後用五倍於此量的培養基來填充色譜柱。
- 一旦確定分離參數，可透過增加色譜柱直徑來增大色譜柱容積，從而擴大純化規模。避免增加色谱柱的长度，因为这会改变分离条件。IEX 媒介可裝入 Cytiva 提供的 Tricorn 或 XK 色譜柱。色譜柱步驟示範：
- 將所有材料平衡至進行分離的溫度。
- 使用建議的緩衝液沖洗柱端部件，以消除空氣。確保柱網下方無空氣殘留。
- 輕輕地重新懸浮培養基。
請注意，Cytiva 的 IEX 培基即開即用。
避免使用磁力攪拌器，因為它們可能會損壞基質。
- 根據提供的建議估算所需的漿液（重懸介質）量。
- 立即將緩衝液注入柱中。
- 安裝柱頂片並連接到泵。
- 打開柱出口，將泵設置為所需流速。
當漿液體積大於柱的總體積時，連接第二根玻璃柱作為儲存庫（詳見訂購資訊）。這可確保漿液在填料過程中直徑恒定，最大程度減少湍流，改善色譜柱填料條件。
如果無法獲得推薦流速，請使用泵可提供的最大流速。
請勿超過介質或色柱的最大工作壓力。
- 在獲得恆定的色床高度後，保持填料流速至少 3 個色柱體積。
在任何純化過程中，請勿超過 75% 的填料流速。
- 停止泵並關閉柱出口。
- 將轉接頭以一定角度插入色譜柱，確保網下沒有殘留的空氣。
- 將轉接頭沿色譜柱緩慢下滑（轉接頭的出口應打開），直至到達標記。
- 將色谱柱連接到泵，並開始平衡。如有必要，重新定位適配器。
必須徹底清洗培養基，以去除儲存溶液，通常為 20% 乙醇。殘留的乙醇可能會干擾後續程序。
使用含有抗菌劑的無菌磷脂缓冲液平衡的許多培養基可以在 +4 °C 儲存長達 1 個月，但請務必遵循產品隨附的特定儲存說明。
色谱柱选择
Tricorn 和 XK 色谱柱与现代培养基可达到的高流速完全兼容，并有多种色谱柱尺寸可供选择。最適合填料 IEX 介質的色譜柱列於每種 IEX 介質的色譜柱填料部分。在大多數情況下，IEX 媒介的容量和需要純化的樣品量將決定所需的色譜柱尺寸。如需完整清單，請參閱 Cytiva BioDirectory™ 或網路目錄 (https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research) 或造訪 www.tricorncolumns.com，以瞭解更多關於 Tricorn 色譜柱的詳細資訊。
色谱柱填料和效率
N = 5.54 × (VR/Wh)2
VR = 從開始使用樣品到峰值最大值的洗脱量
wh = 峰寬，以記錄峰高一半處的峰寬測量
H 由表達式計算：
H = L
N
L = 填料床的高度。
VR和wh的測量可以用距離（mm）或體積（mL）來表示，但這兩個參數必須用相同的單位來表示。
應定期注入丙酮檢查色譜柱性能，以確定色譜柱效率（N）和峰對稱性（不對稱因數，As）。由於 N 的觀察值取決於實驗因素，如流速和樣品載量，因此必須在相同條件下進行比較。在 IEX 中，效率是在等度條件下測量的，方法是注入丙酮（不與介質互動）並測量洗出峰，如 圖 92.
所示。
圖 92.
一般而言，良好的 H 值約為包裝介質平均顆粒直徑的兩到三倍。對於 90 μm 的顆粒，這表示 H 值為 0.018-0.027 cm。
對稱因數 (As) 表示為：
As = b
a
其中
a = 峰高 10% 處的前半峰寬
b = 峰高 10% 處的後半峰寬
As 應盡可能接近 1。IEX 中使用的短色谱柱的合理 As 值为 0.80-1.80。
广泛的前缘通常表示介质填充得太紧，而广泛的尾部通常表示介质填充得太松。 ；
將至少兩個柱容量的緩衝液通過新填料的色譜柱，以確保介質與起始緩衝液達到平衡。使用 pH 監測來檢查洗出液的 pH 值。
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