Duolink^® PLA 探針製作指南

本指南說明使用 Duolink^® In Situ Probemaker 將 PLA 寡核苷酸（PLUS 或 MINUS）與任何抗體結合，用於 Duolink^® PLA 實驗。Probemaker 生成的 PLA 抗体可与标准 Duolink^® PLA 探针结合使用，也可独立于标准 Duolink^® PLA 探针使用，只要使用一个 PLUS PLA 探针和一个 MINUS PLA 探针即可。有關 Probemaker 應用的更多資訊，請造訪 Create Your Own PLA^® Probes 和 Duolink^® PLA Troubleshooting Guide 的 Duolink^® Probemaker 部分。

若要熟悉 Duolink^® PLA 技術，如何優化 Duolink^® Proximity Ligation Assay，以瞭解更多詳細資訊。Duolink^® PLA 協議以及使用 Probemaker 生成的 PLA 抗體所需的其他 Duolink^® PLA 試劑的相關資訊，請參閱 Duolink^® Resource Center.

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應用
材料和設備
Duolink^®PLA Probemaker 共聚協議
Troubleshooting

應用

Duolink^® Probemaker 適用於單獨使用目前的 Duolink^® PLA 探針不可行或不理想的情況。本節提供 Duolink^® Probemaker 的常見應用。

1.使用來自同一物種的一抗

當使用來自同一物種的兩種一抗時，可使用 Duolink^® Probemaker 將其中一種抗體與 PLA PLUS 寡核苷酸結合，而將另一種抗體與 PLA MINUS 寡核苷酸結合。當只使用直接結合的一抗，不需要二抗或 Duolink^® PLA Probe，PLA 方案中的這一步驟應該取消。

2. 使用來自任何物種的一抗

Duolink^® PLA 探針目前提供的是 PLA 結合的二抗，可辨識來自小鼠、家兔或山羊的 IgG。當使用來自小鼠、兔子或山羊以外物種的兩種一抗時，Duolink^® Probemaker 可用聚乳酸寡核苷酸標記一抗或適當的二抗。將其中一種抗體與 PLA PLUS 寡核苷酸結合，另一種抗體與 PLA MINUS 寡核苷酸結合。

當只有一種一抗是來自小鼠、兔或山羊以外的物種時，只要使用一個PLUS PLA探針和一個MINUS PLA探針，就可以使用Duolink^® Probemaker產生的PLA抗體和標準Duolink^® PLA探針的組合。

3、「小鼠對小鼠」）

使用源自小鼠的一抗染色小鼠組織通常會導致高背景，這是由於二抗與被染色組織中的內源性小鼠 IgG 以及 B 細胞、浆细胞和巨噬細胞上的 Fc 受體結合所致。為了繞過抗小鼠二抗的使用並降低背景，Duolink^® Probemaker 可用來直接將小鼠衍生的一抗與 PLA 寡核苷酸結合。

Materials and Equipment

Duolink^® Probemaker Reagents

請參閱 Duolink^® PLA 產品選擇指南，以瞭解具體的產品建議。Duolink^® Probemaker允許您建立自訂的PLA寡聚結合抗體，可與標準的Duolink^® Probemaker結合或獨立使用。/sup> PLA 探針，只要使用 MINUS PLA 探針即可。每個 Duolink^® PLA Probemaker 套件包含的試劑可結合 20 µg 抗體，濃度為 1 mg/mL。試劑包括以下各項：

1. Duolink^® PLA 寡核苷酸 - 一小瓶凍乾、活化的寡核苷酸（PLUS 或 MINUS）
2. 結合緩衝液 - 用於緩衝結合反應
3. Stop Reagent - 用於停止結合反應
4. Storage Solution - 用於保存結合抗體
5. Stop Reagent - 用於停止結合反應
6. 20x 分析試劑 - 必要時加入實驗者優化的抗體稀釋液中
7. 阻斷液 - 用於阻斷一抗前的樣品
8. PLA 探針稀釋液 - 用於稀釋結合抗體（PLA 探針）至最終檢測濃度

注意：所有試劑儲存於 -20 °C。抗體結合後，請儲存於 4 °C。

附加材料

1. 第一或第二抗體- 用於與 PLA 寡核苷酸（PLUS 和/或 MINUS）結合。要參與結合，抗體必須符合下列條件：

   1. 要結合的抗體濃度必須達到 1 mg/mL。每次共轭需要 20 µg (=20 µL) 抗体。

      注意：如果使用单克隆抗体，它应该是蛋白 A 或蛋白 G 亲和纯化的。

   2. 抗體必須在不含胺的緩衝液中，最好是 PBS。緩衝液應不含載體和防腐劑，但可能含有0.1% BSA、5% 樹脂糖和0.02% 疊氮化鈉。

      注意：如果抗體儲存的緩衝液成分不明，建議在結合前進行透析或緩衝液交換。

      注意：除非您有大量抗體，否則不建議在Duolink^® In Situ Probemaker結合前濃縮非常稀釋的抗體，因為過濾型濃縮器的損失非常高。

2. 1x PBS - 如果需要，用于抗体的缓冲液交换。建議的緩衝液交換程序如下：

   注意：此程序不適用於還原高濃度的 BSA 或其他大分子。

   1. 用 1x PBS 預平衡旋轉柱，首先以 3000 rpm 旋轉柱 1 分鐘，然後加入 400 µL 1x PBS 再旋轉 1 分鐘，重複 4 次。

   2. 將抗體（12-50 µL）加入柱中，以 3000 rpm 再旋轉 2 分鐘。收集的抗體濃度應以 OD 值驗證。1 mg/mL 的 OD 280 nm 應為 1.4。

   注意：Microcon-10 離心過濾器效果很好（產品編號 MRCPRT010）。

Duolink^® PLA Probemaker 共轭协议

共轭协议描述了如何将 PLA 寡核苷酸（PLUS 或 MINUS）共轭到任何抗体上。在開始之前，確保要結合的抗體是在濃度為 1 mg/mL 的無胺緩衝液中。抗體緩衝液應不含載體和防腐劑，但可能含有 0.1% BSA、5% 曲哈糖和 0.02% 疊氮化鈉。

1. 在 20 µL 待結合抗體中加入 2 µL 結合緩衝液。抗體濃度應為 1 mg/mL。
2. 用移液管輕輕地混合。
3. 將抗體溶液轉移到一小瓶凍結少核苷酸（PLUS 或 MINUS）中。
   注意：打開凍結寡核苷酸小瓶後立即加入抗體溶液。
4. 室溫孵育過夜。
5. 加入 2 µL 停止試劑到反應中。
6. 室溫孵育 30 分鐘。
7. 加入 24 µL 儲存液，必要時加入其他試劑以穩定特異性抗體。
   
8. 穩定完成後，PLA 探針可儲存於 4 °C 的儲存液中。

Duolink^® PLA 檢測協議

The Duolink^®聚乳酸螢光協議或Duolink^® PLA Brightfield Protocol只要使用 PLUS PLA 結合抗體和 MINUS PLA 結合抗體，就可以結合或獨立於標準 Duolink^® PLA 探針，使用 Probemaker 產生的抗體。請根據您的 PLA 探針注意以下可能影響您實驗的變更：

1. Probemaker試劑盒中的PLA探針稀釋液應在螢光和明視野方案中代替Duolink^®抗體稀釋液使用。

2. 選擇性：當使用定制的抗體稀釋液代替提供的PLA探針稀釋液時，建議在使用PLA結合抗體之前， 20x Assay Reagent在定制的抗體稀釋液中稀釋1:20。

3. 在螢光和明視野方案的適當步驟中孵育PLA結合抗體。如果一抗被用於結合，在一抗孵育步驟中使用它們（螢光，步驟2；光場，步驟3）。如果二抗用於結合，則在 PLA 探針孵育步驟（螢光，步驟 3；明視場，步驟 4）中使用它們。

4. 僅使用直接結合的一抗時，不需要二抗或 Duolink^® PLA Probe。因此，跳過螢光（步驟 3）和光場（步驟 4）方案中的 PLA 探針孵育步驟。對於任何其他的 PLA 探針組合，都可以按照所寫的方案進行。

Duolink^® PLA Troubleshooting Guide，以瞭解提示和技巧、一般故障排除指南以及常見問題集 (FAQ)。

如需實驗協助，請隨時與我們的技術支援團隊或當地銷售代表聯絡。

客製化服務

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參考資料

1. Jarvius M, Paulsson J, Weibrecht I, Leuchowius K, Andersson A, Wählby C, Gullberg M, Botling J, Sjöblom T, Markova B, et al. 2007. In SituDetection of Phosphorylated Platelet-derived Growth Factor Receptor ? Using a Generalized Proximity Ligation Method. Mol Cell Proteomics. 6(9):1500-1509. https://doi.org/10.1074/mcp.m700166-mcp200

2. Söderberg O, Gullberg M, Jarvius M, Ridderstråle K, Leuchowius K, Jarvius J, Wester K, Hydbring P, Bahram F, Larsson L, et al. 2006. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nat Methods. 3(12):995-1000. https://doi.org/10.1038/nmeth947

3. Gullberg M, Gustafsdottir SM, Schallmeiner E, Jarvius J, Bjarnegard M, Betsholtz C, Landegren U, Fredriksson S. 2004. Cytokine detection by antibody-based proximity ligation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101(22):8420-8424. https://doi.org/10.1073/pnas.0400552101

4. Fredriksson S, Gullberg M, Jarvius J, Olsson C, Pietras K, Gústafsdóttir SM, Östman A, Landegren U. 2002. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nat Biotechnol. 20(5):473-477. https://doi.org/10.1038/nbt0502-473