體外T 細胞殺死試驗規程

選擇 Millicell^® Microwell 96 孔板

Millicell^® Microwell 96 孔板有多種標準設計，適用於不同的應用：

T Cell Killing Assay Protocol

使用此方案，在單孔中形成腫瘤球體，並與 TILs 共同培養。T 细胞杀伤潜能使用半自动图像分析，并在原位执行。

1. 使用 600μm Millicell^® Microwell 96 孔板中的 O 型環，將人類結腸直腸癌球形細胞形成細胞株送入微孔中。
2. 透過培養基交換口加入培養基。注意：如果需要 ECM，可將其稀釋入培養基，並在此步驟中加入。
3. 讓腫瘤球體生長並完全發育。
4. 添加 TIL，直到達到所需的效靶 (E:T) 比值。注意：本檢驗在免疫調節劑 IL2、CD3（IL2 + -CD3/CD28）和 PD1（IL2 + -CD3/CD28 + -PD1/CTLA4）存在或不存在的情況下進行。
5. 使用細胞追蹤器¹監測隨時間變化的生長情況。在這項檢測中，腫瘤細胞、T 細胞和死亡細胞分別用遠紅色追蹤劑（藍色，CellTrace™ Far Red Cell Proliferation Kit; Molecular Probes）、CFSE（綠色）和碘化丙啶（紅色）標記。

對於 T 細胞染色：

1. 將細胞重懸於 CFSE 染色液中（1:200 於檢測緩衝液中，再以 1:2 於溫 PBS 稀釋），並於 37˚C 孵育 20 分鐘。
2. 加入等容量的含 10% FBS 的培養基，培養 10 分鐘。
3. 以 200xg 脫水 5 分鐘。
4. 將細胞重懸於所需濃度的培養基；例如 10M cells/ml。

對於器官樣染色：

5. 將細胞重懸於 1ml 含微量（1:1000）的溫 PBS 中，在 37˚C 孵育 20 分鐘。
6. 加入等量的培養基（DMEM + 10% FBS），37˚C 培養 5 分鐘。
7. 將細胞重懸於 1 ml 培養基。

6. 加入碘化丙啶染色以評估 T 細胞殺害。碘化丙啶的稀釋取決於供應商的建議。
7. 進行半自動圖像分析，量化細胞死亡、腫瘤大小和 TIL 移動。

Millicell^®微細孔 T 細胞殺死結果 

Millicell^{®體內發生的情況。由於單孔中可評估多個均勻的腫瘤球體，因此每孔的數據點數量顯著增加。}

我們的檢測結果顯示，在免疫檢查點抑制劑存在的情況下，選定的患者樣本具有自主的 T 細胞活化和增加的細胞毒性反應。在球形細胞形成後的第 3 天，在免疫調節劑存在的情況下，腫瘤球形細胞的總面積減少了（圖 4）。這顯示免疫調節劑的加入導致腫瘤死亡和縮小。更高的效靶比會導致更有效的殺害。這可以透過螢光成像觀察到碘化丙啶信號的增加。

這種檢測方法使用 Pmel-1 轉基因小鼠模型進行了驗證。黑色素瘤腫瘤球體在有 T 細胞存在的情況下被破壞，但在沒有 T 細胞的情況下仍能穩定生長。正如在體外T細胞殺死實驗中所看到的，高E:T比率會導致更有效的腫瘤殺死。