Wstrzykiwalne hydrożele do regeneracji tkanek
Prathamesh M. Kharkar1, April M. Kloxin1,2
1Materials Science and Engineering and , 2Chemical and Biomolecular Engineering, University of Delaware, Newark, DE 19716 USA
Wprowadzenie
Zastosowanie biomateriałów na bazie hydrożeli do dostarczania i rekrutacji komórek w celu promowania regeneracji tkanek w organizmie cieszy się rosnącym zainteresowaniem.1 Hydrożele to hydrofilowe, spęcznione wodą sieci polimerowe utworzone z różnych naturalnych i syntetycznych polimerowych bloków budulcowych (Rysunek 1). Te bloki budulcowe zostały zaprojektowane tak, aby umożliwić sieciowanie poprzez reakcję chemiczną lub poprzez fizyczne interakcje w obecności komórek i białek, które przebiegają wystarczająco szybko do wstrzykiwania i in situ tworzenia hydrożeli. W tym artykule dokonujemy przeglądu zasad projektowania tych wstrzykiwalnych hydrożeli, postępów w zakresie polimerów i chemikaliów do ich tworzenia oraz najnowszych przykładów ich zastosowania do regeneracji tkanek.
Rysunek 1.Wstrzykiwalne hydrożele do dostarczania komórek i zastosowań w inżynierii tkankowej. Wstrzykiwalne hydrożele mogą być przygotowywane przy użyciu różnych naturalnych i syntetycznych polimerów, rekombinowanych białek i peptydów. Te materiały bazowe zostały usieciowane w obecności komórek, substancji biologicznych i tkanek za pomocą reakcji chemicznych lub oddziaływań fizycznych. Takie wstrzykiwane hydrożele tworzone in situ zostały wykorzystane do dostarczania różnych komórek terapeutycznych lub leków biologicznych (np. czynników wzrostu, chemokin do modulowania funkcji endogennych komórek) w celu promowania regeneracji tkanek, w tym kości, chrząstki i skóry (przedstawione tutaj).
Polimerowe bloki konstrukcyjne do projektowania hydrożeli do wstrzykiwania
Hydrożele do wstrzykiwania są przygotowywane przy użyciu szerokiej gamy materiałów. Cyto- i biokompatybilność, a także reaktywne związki chemiczne są krytycznymi czynnikami przy wyborze materiałów bazowych, które mogą być stosowane w hydrożelach do dostarczania lub rekrutacji komórek w organizmie. Sieciowanie materiału (tworzenie i stężenie wiązań fizycznych lub kowalencyjnych), biodegradowalność i właściwości biochemiczne są również ważnymi kryteriami projektowymi, które mogą wpływać na strukturalne, mechaniczne i biologiczne właściwości hydrożeli początkowo i z czasem. Ponadto podstawowe materiały polimerowe muszą być stabilne w postaci stałej lub roztworu do przechowywania przed użyciem w badaniach translacyjnych lub klinicznych.
Polimery hydrofilowe stosowane do budowy hydrożeli można ogólnie podzielić na dwie kategorie: polimery naturalne pochodzące z tkanek lub innych źródeł naturalnych oraz polimery syntetyczne wytwarzane przy użyciu chemii organicznej i zasad inżynierii molekularnej. Biokompatybilne polimery naturalne, takie jak kwas hialuronowy, chitozan (Prod. Nr. 448869, 448877, i 419419), heparyna, alginian, fibryna (Prod. Nr F5386), kolagen (Nr prod. Nr. 804592, 804622, and 804614), siarczan chondroityny i jedwab, naśladują aspekty natywnego mikrośrodowiska, w tym jego właściwości mechaniczne i biochemiczne do modulowania adhezji komórek, migracji i innych kluczowych funkcji regeneracji tkanek.2 Te naturalne polimery zostały wykorzystane jako bloki budulcowe do tworzenia hydrożelu do wstrzykiwania poprzez fizyczne (np, jonowe, wiązania wodorowe) lub sieciowanie kowalencyjne (np, reakcja grup funkcyjnych na zmodyfikowanych polimerach).3 Syntetyczne polimery, takie jak poli(glikol etylenowy) [PEG], poli(alkohol winylowy) [PVA], poli(N-izopropyloakrylamid) [PNIPAAm] i polikaprolakton [PCL] były często wykorzystywane do projektowania wstrzykiwalnych, kompatybilnych z komórkami hydrożeli ze względu na ich dostępność handlową, niską zmienność między partiami, wszechstronność modyfikacji chemicznej, a co za tym idzie, łatwość dostrajania właściwości mechanicznych powstałych hydrożeli. Ponieważ syntetycznym polimerom brakuje nieodłącznych biochemicznych wskazówek dotyczących interakcji z komórkami, są one stosowane w połączeniu z naturalnymi polimerami lub peptydami biomimetycznymi w celu ułatwienia adhezji komórek, migracji i wydzielania białek.
Aby uchwycić korzystne cechy zarówno tradycyjnych polimerów naturalnych, jak i syntetycznych, syntetyczne peptydy i rekombinowane białka zostały zaprojektowane do wstrzykiwania, a następnie montażu in situ w celu dostarczania komórek. Przykłady takich kombinacji obejmują białka zawierające żywicę, sekwencje bogate w tryptofan i prolinę w dwuskładnikowych hydrożelach indukowanych mieszaniem (MITCH) oraz amfifile peptydowe z hydrofilowymi segmentami peptydowymi (powtórzenia lizyny lub kwasu glutaminowego) sprzężonymi z hydrofobowym kwasem tłuszczowym.4 Te projektowane bloki konstrukcyjne zostały zaprojektowane z sekwencjami peptydowymi wiążącymi integryny w celu promowania adhezji komórek i degradowalnych sekwencji do przebudowy napędzanej przez komórki. Tutaj skupimy się na kilku polimerach powszechnie stosowanych w projektowaniu wstrzykiwanych hydrożeli do dostarczania komórek i regeneracji tkanek.
Kwas hialuronowy (HA) (nr prod. H5542) jest nieimmunogennym, biokompatybilnym glikozaminoglikanem występującym w macierzy zewnątrzkomórkowej tkanki łącznej, nabłonkowej i nerwowej. Biomateriały na bazie HA ulegają degradacji in vivo w odpowiedzi na hialuronidazę i zostały wykorzystane do różnych zastosowań biomedycznych.5 Young i wsp. zgłosili zastosowanie wstrzykiwanych hydrożeli HA do dostarczania komórek progenitorowych siatkówki (RPC) do naprawy siatkówki.6 Dostępny na rynku HA z funkcjonalizacją tiolową poddano reakcji z PEG z funkcjonalizacją akrylową w celu utworzenia chemicznie usieciowanych hydrożeli w obecności mysich komórek progenitorowych siatkówki. Wstrzyknięte hydrożele spowodowały równomierne rozmieszczenie RPC w przestrzeni podsiatkówkowej, które różnicowały się w kierunku pożądanych fotoreceptorów. HA został zmodyfikowany wieloma reaktywnymi grupami funkcyjnymi istotnymi dla formacji in situ po wstrzyknięciu.7 W niedawnym przykładzie Burdick i wsp. zmodyfikowali HA aldehydowymi i hydrazynowymi grupami funkcyjnymi w celu stworzenia wstrzykiwalnych hydrożeli, które uwalniają rekombinowany tkankowy inhibitor metaloproteinaz macierzy (TIMP3) i modulują aktywność miofibroblastów w celu poprawy regeneracji tkanki po zawale mięśnia sercowego.8
Alginian, (Prod. No. 180947), kationowy biopolimer otrzymywany z alg brunatnych, był wcześniej używany w kilku zastosowaniach klinicznych, w tym jako materiał do opatrywania ran. W obecności kationów dwuwartościowych alginian tworzy fizycznie usieciowane hydrożele, w których właściwości mechaniczne można regulować poprzez zmianę ilości polimeru, masy cząsteczkowej i stężenia kationów sieciujących. Hydrożele do wstrzykiwania na bazie alginianu zostały wykorzystane do regeneracji różnych tkanek, w tym kości, chrząstki, tkanki tłuszczowej i tkanki serca.9 Kim i wsp. wykazali tworzenie tkanki tłuszczowej poprzez wstrzykiwanie hydrożeli alginianowych obciążonych wstępnie kondycjonowanymi kriokonserwowanymi ludzkimi komórkami macierzystymi tkanki tłuszczowej (hADSC) in vivo u myszy.10 Przed wstrzyknięciem, alginian został utleniony w celu poprawy jego biodegradowalności i zmodyfikowany przy użyciu chemii karbodiimidu z peptydem wiążącym integrynę (G4RGDASSKY) w celu promowania adhezji komórek. W ciągu 10 tygodni hydrożele zawierające hADSC spowodowały powstanie tkanki tłuszczowej (~50% początkowej objętości żelu), podczas gdy kontrola negatywna (hydrożele bez komórek) nie spowodowała powstania nowej tkanki. Oprócz HA i alginianu, hydrożele do wstrzykiwań zostały przygotowane przy użyciu wielu innych naturalnych polimerów, w tym chitozanu, heparyny, kolagenu, żelatyny, siarczanu chondroityny lub ich kombinacji, w celu regeneracji chrząstki, kości i tkanki serca.11
PEG jest jednym z najczęściej stosowanych syntetycznych polimerów do przygotowywania wstrzykiwanych hydrożeli ze względu na jego biokompatybilność i brak miejsc wiązania białek. PEG zapewnia względnie obojętną biologicznie bazę do wprowadzania określonych grup bioaktywnych (np. peptydów) w celu modulowania interakcji z komórkami i został zmodyfikowany różnymi grupami końcowymi, w tym aminami, tiolami, maleimidami, akrylanami i norbornenami, które są łatwo syntetyzowane lub uzyskiwane komercyjnie.12 Kilka grup badawczych, w tym nasza, opracowało hydrożele na bazie PEG do dostarczania komórek i regeneracji tkanek. Na przykład, Garcia i wsp. niedawno wykorzystali makromery PEG sfunkcjonalizowane maleimidami i peptydami sfunkcjonalizowanymi tiolami (tj, cysteiny) do tworzenia wstrzykiwalnych hydrożeli do dostarczania komórek.13 Hydrożele te utrzymywały żywotność komórek progenitorowych (C2C12) (nr prod. 91031101) podczas enkapsulacji, gdzie czasy sieciowania wahały się od 1 do 5 minut w zależności od stężenia polimeru i promowały rozprzestrzenianie się komórek.
Reakcje sieciowania i degradacji w celu kontrolowania tworzenia i erozji hydrożeli
Hydrożele do wstrzykiwań są tworzone przy użyciu różnych chemicznych lub fizycznych strategii sieciowania, które muszą być starannie dobrane do konkretnego zastosowania. Na przykład, odpowiednia szybkość sieciowania jest niezbędna do prawidłowego formowania wstrzykiwanego hydrożelu in situ. Jeśli żelowanie jest zbyt wolne, prekursory mogą perfundować z miejsca wstrzyknięcia do otaczających tkanek, prowadząc do słabych właściwości hydrożelu i potencjalnie do reakcji zapalnej na nieprzereagowane monomery. Jeśli żelowanie jest zbyt szybkie, może wystąpić rozrzedzenie ścinające (i potencjalnie przedwczesne tworzenie żelu) w strzykawce, wprowadzając defekty sieci, które z kolei wpływają na właściwości mechaniczne żelu i zatrzymywanie/uwalnianie ładunku (tj. komórek). Ponadto, zdolność do tworzenia hydrożelu w obecności żywych komórek i białek terapeutycznych jest kluczem do dostarczania komórek i zastosowań w medycynie regeneracyjnej.
Ze względu na szybką kinetykę sieciowania i wysoką wydajność, chemia typu "click" stanowi jedną z najbardziej atrakcyjnych klas chemikaliów sieciujących do tworzenia hydrożeli do dostarczania komórek. Powszechnie stosowane katalizowane miedzią reakcje klikania alkinów i azydków zostały wykorzystane do tworzenia hydrożeli;14 jednak miedź może być cytotoksyczna, a jej użycie ogranicza możliwość zastosowania w aplikacjach do enkapsulacji i dostarczania komórek. Aby temu zaradzić, do sieciowania cytokompatybilnych hydrożeli wykorzystano cykloaddycje azydkowo-alkilowe (SPAAC). DeForest i Anseth zgłosili zastosowanie SPAAC do enkapsulacji fibroblastów w hydrożelach.15 Autorzy wykazali, że gdy czteroramienny PEG funkcjonalizowany na końcu difluorowanym cyklooktynem reaguje z peptydowym środkiem sieciującym z funkcjonalizacją azydkową, odkształcenie pierścienia i wycofujące elektrony podstawniki fluorowe promują szybką reakcję sieciowania (~ 2 minuty) bez katalizatora. W innym podejściu, Dove i wsp. niedawno opisali bezkatalizatorową reakcję chitozanu funkcjonalizowanego azydkiem z PEG funkcjonalizowanym kwasem propionowym w celu utworzenia hydrożeli w obecności komórek.16 Autorzy byli w stanie otoczyć mezenchymalne komórki macierzyste podczas tworzenia hydrożelu i wykazali, że otoczone komórki wykazują wysoką żywotność po 24 godzinach hodowli (95%). Te i inne reakcje typu "click", w tym tiol-eny (w szczególności addycje Michaela tioli z maleimidami lub sulfonami winylowymi), reakcje Dielsa-Aldera, aldehyd-hydrazyna i oksym, są atrakcyjne dla zastosowań w hydrożelach do wstrzykiwania. W celu uzyskania kompleksowego podsumowania reakcji sieciowania chemicznego, czytelnicy są odsyłani do najnowszych artykułów przeglądowych.3,12,17
Fizycznie usieciowane wstrzykiwalne hydrożele zostały utworzone przy użyciu wiązań jonowych, hydrofobowych, wodorowych lub oddziaływań gość-gospodarz, najczęściej poprzez oddziaływania termoresponsywne i jonowe.18 Reis i in. opisali tworzenie wstrzykiwalnych hydrożeli przy użyciu termoresponsywnej poli(N-izopropyloakryloamidu)-g-metylocelulozy (PNIPAAm-g-MC) do zastosowań w inżynierii tkanki chrzęstnej.19 Tworzenie hydrożelu zostało osiągnięte przy użyciu termoresponsywnego przejścia fazowego polimeru PNIPAAmg- MC z żelowaniem występującym powyżej jego dolnej krytycznej temperatury roztworu (~32 °C). Zamknięte komórki chondrogenne ATDC5 przyjęły zaokrągloną morfologię, wspierając utrzymanie fenotypu chondrocytów, który ma kluczowe znaczenie dla regeneracji chrząstki stawowej. Fizyczne sieciowanie przy użyciu oddziaływań jonowych jest szeroko stosowane do sieciowania polisacharydów, takich jak alginian i chitozan. Na przykład Xu i wsp. zamknęli ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pępowiny (hUCMSCs) w hydrożelach do wstrzykiwań na bazie alginianu do inżynierii tkanki kostnej.20 Żelowanie alginianu osiągnięto poprzez sieciowanie wapniem, kationem dwuwartościowym w obecności hUCMSCs o żywotności ~ 70% po kapsułkowaniu.
W przypadku wszystkich zastosowań związanych z dostarczaniem komórek i regeneracją tkanek, hydrożele muszą ulegać degradacji w kontrolowany sposób po wstrzyknięciu w celu pożądanego zastosowania terapeutycznego (np, uwalnianie lub infiltracja komórek, tworzenie białek) bez cytotoksycznych produktów ubocznych degradacji. Zazwyczaj degradację można osiągnąć za pomocą rozszczepialnych szkieletów polimerowych lub dynamicznych/odwracalnych wiązań krzyżowych. Jak wspomniano wcześniej, naturalne polimery, takie jak kwas hialuronowy i alginian, ulegają hydrolizie enzymatycznej in vivo, zapewniając mechanizm degradacji hydrożelu. W przypadku polimerów syntetycznych, hydrożele były tradycyjnie projektowane z wiązaniami estrowymi, takimi jak poli(kwas mlekowy), w celu degradacji przez hydrolizę estrów w mikrośrodowiskach wodnych zaprogramowanych na podstawie liczby włączonych estrów. Ponadto kilka grup badawczych zbadało dodatkowe reagujące lub wyzwalane degradowalne substancje chemiczne, w tym fotodegradację,21 typu retro Michael,22 i retro reakcje Dielsa-Aldera,23 dla precyzyjnej kontroli nad degradacją materiału in situ. Niedawno, we współpracy z grupą badawczą Kiick, osiągnęliśmy precyzyjną kontrolę nad degradacją wstrzykiwanych hydrożeli utworzonych za pomocą chemii tiolowo-maldeimidowej poprzez włączenie dwóch lub więcej trybów degradacji przy użyciu kombinacji tych chemikaliów.24 Degradacja hydrożelu w wielu skalach czasowych została osiągnięta poprzez włączenie: i) o wiązań eteru nitrobenzylowego, które ulegają fotodegradacji (k ~ 10-1 min-1 dla 365 nm do 10-2 min-1 dla 400-500 nm); ii) arylowo-tiolowe wiązania bursztynoimidowo-tioeterowe, które ulegają reakcji typu retro Michaela w obecności glutationu (k ~ 10-3 min-1); oraz iii) wiązania estrowe, które ulegają hydrolizie estrowej w mikrośrodowiskach wodnych (k ~ 10-4 min-1). Zasadniczo takie wstrzykiwalne hydrożele o multimodalnej degradowalności mogą być wykorzystywane do dostarczania lub rekrutacji komórek z precyzyjną i dostosowaną kontrolą nad degradacją żelu i profilami uwalniania w celu regeneracji tkanek.
Dostarczanie komórek i regeneracja tkanek z in situ formowaniem hydrożeli
.Wstrzykiwane hydrożele zostały wykorzystane do dostarczania różnych cząsteczek ładunku, w tym czynników wzrostu, chemokin i komórek terapeutycznych w celu promowania regeneracji tkanek in vitro i in vivo. Materiały te są wykorzystywane do regeneracji różnych tkanek, w tym kości, chrząstki, krążka międzykręgowego, tkanki tłuszczowej, serca i naczyń krwionośnych. Kilka ostatnich przykładów wstrzykiwanych hydrożeli stosowanych do regeneracji tkanki kostnej, chrzęstnej i sercowej zostało tutaj wyróżnionych. Kompleksowy przegląd tego rozwijającego się obszaru badawczego można znaleźć w najnowszym artykule przeglądowym.25
Kość
Radzenie sobie z wadami i nieprawidłowościami kości jest jednym z kluczowych wyzwań w ortopedii. Strategie inżynierii tkanki kostnej wykorzystujące wstrzykiwane hydrożele stanowią atrakcyjną alternatywę dla tradycyjnych metod leczenia, takich jak autologiczna implantacja kości i materiały do przeszczepów kostnych, jak wykazano w przełomowych pracach Hubbell i wsp.26 Ostatnio Song i wsp. badali zastosowanie wstrzykiwanych termoresponsywnych hydrożeli na bazie poli(fosfazenu) do długotrwałego dostarczania białka morfogenetycznego kości-2 (BMP-2) (Prod. Nr H4791).27 Poli(fosfazen) z dodatkowymi grupami karboksylowymi, które promują interakcje jonowe z BMP-2, zostały użyte do utworzenia hydrożeli po wstrzyknięciu, gdzie żelowanie następuje, gdy temperatura zbliża się do temperatury fizjologicznej (37 °C). Przedłużone uwalnianie BMP-2 z takich hydrożeli przez 20 dni zostało osiągnięte in vitro i spowodowało znacznie wyższe wydzielanie osteokalcyny (~14 ng/ml) przez komórki C2C12 (Prod. No. 91031101) w porównaniu do kontroli (~2 ng/ml), co sugeruje zachowanie bioaktywności BMP-2 dla różnicowania osteoblastycznego. Wstrzyknięcie hydrożeli obciążonych BMP-2 in vivo spowodowało ektopowe tworzenie kości u myszy, podkreślając obietnicę wstrzykiwanych hydrożeli do regeneracji kości.
Chrząstka
Ze względu na ograniczoną zdolność samoleczenia tkanek chrzęstnych, opracowano szereg zabiegów chirurgicznych w celu promowania regeneracji chrząstki. Wśród nich zastosowanie wstrzykiwanych lub in situ tworzących hydrożeli do dostarczania czynników wzrostu i komórek terapeutycznych w miejscu uszkodzenia chrząstki jest jedną z pojawiających się strategii.28 Jin i wsp. opisali wstrzykiwane i biodegradowalne hydrożele utworzone przy użyciu dekstranu i kwasu hialuronowego do inżynierii tkanki chrzęstnej. Szybkie tworzenie hydrożelu (~2 minuty) osiągnięto za pomocą oksydacyjnego sprzęgania grup fenolowych w obecności peroksydazy chrzanowej (Prod. No. 77332) i nadtlenku wodoru (H2O2, Prod. Nr H3410). Chondrocyty bydlęce zachowują wysoką żywotność komórek podczas procesu enkapsulacji (~95%) i wykazują zwiększoną produkcję glikozaminoglikanów i kolagenu w ciągu 21 dni. W przypadku tego typu napraw konieczny jest zabieg chirurgiczny w celu uzyskania dostępu do tkanki. W związku z tym wykorzystano również inne reaktywne substancje chemiczne, które umożliwiają szybkie, wyzwalane tworzenie żelu in situ (np. fotopolimeryzowany metakrylan lub systemy tiol-enowe29) i stanowią aktywne obszary badań nad regeneracją tkanek w niejednorodnych miejscach uszkodzenia. Takie hydrożele tworzące się in situ są obiecujące dla naprawy uszkodzeń chrząstki.
Tkanki sercowo-naczyniowe
Choroby sercowo-naczyniowe to kolejny wymagający obszar, w którym hydrożele do wstrzykiwania oferują obiecujące możliwości leczenia. Aby sprostać wyzwaniom związanym z przewlekłym zawałem mięśnia sercowego, Park i wsp. opracowali hydrożele tiolowe, które wykorzystują akrylowany kwas hialuronowy i zawierający tiol peptydowy środek sieciujący wrażliwy na MMP, aby modulować aktywność komórkową w kierunku regeneracji tkanek.30 W szczególności chemokina, czynnik pochodzenia stromalnego-1 (SDF-1) (Prod. Nos. Nr.SRP3253 oraz SRP3276), która odgrywa kluczową rolę w naprawie.), który odgrywa kluczową rolę w naprawie zawału mięśnia sercowego i Ac-SDKP (peptyd, który stymuluje proliferację komórek śródbłonka i angiogenezę) zostały włączone do roztworu prekursora hydrożelu. Po wstrzyknięciu do nasierdzia w modelu zawału mięśnia sercowego utworzono hydrożele obciążone białkami, a funkcje serca oceniono po 4 tygodniach. Oceny te wykazały, że wstrzyknięcie hydrożeli zawierających SDF-1 i SDKP poprawiło funkcję komory, zwiększyło angiogenezę, zmniejszyło rozmiar zawału (~ 8% dla SDF-1/SDKP w porównaniu do ~ 41% dla kontroli) i zwiększyło grubość ściany (211% więcej w porównaniu do kontroli) w obszarze zawału. Wyniki te pokazują przydatność wstrzykiwanych hydrożeli do modulowania funkcji komórkowych, w tym komórek endogennych, w celu regeneracji tkanek.
Wnioski
W ciągu ostatniej dekady wstrzykiwane hydrożele pojawiły się jako obiecujące biomateriały do dostarczania komórek lub rekrutacji w celu promowania regeneracji tkanek. Dokonano znaczących postępów w projektowaniu polimerów bazowych i chemii sieciowania do tworzenia hydrożeli oraz rozszczepialnych i odwracalnych chemikaliów do degradacji hydrożeli, zarówno w obecności komórek, jak i tkanek. Podejścia te utrzymują bioaktywność dostarczanych komórek terapeutycznych i leków biologicznych oraz prowadzą do postępów w zakresie jakości i funkcji regenerowanych tkanek.
Podziękowania
Autorzy z wdzięcznością dziękują za wsparcie powiązanych prac z programu Delaware COBRE z grantem z National Institute of General Medical Sciences (NIGMS P20GM104316-02), z National Institutes of Health, Burroughs Wellcome Fund i University of Delaware Research Foundation. Dziękujemy MediaLab na Wydziale Biochemii Uniwersytetu Wisconsin w Madison za wykorzystanie szablonu Adobe Illustrator.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?