Bioprinting dla inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej
Chi-Chun Pan1,2, Arnaud Bruyas1, Yunzhi Peter Yang3,4
1Departments of Orthopedic Surgery, 2Mechanical Engineering, 3Materials Science and Engineering, 4Bioengineering Stanford University, 300 Pasteur Drive, Stanford, CA 94305
Wprowadzenie
W ciągu ostatnich dwóch dekad inżynieria tkankowa i medycyna regeneracyjna stały się ważnymi dziedzinami interdyscyplinarnymi, które obejmują biologię, chemię, inżynierię i medycynę.1,2 Te nowe dziedziny promują leczenie i przywracanie utraconych funkcji w uszkodzonych lub chorych tkankach i narządach poprzez łączenie rusztowań, komórek i biologicznych cząsteczek sygnalizacyjnych w celu odtworzenia funkcjonalnych substytutów biologicznych i naśladowania natywnych tkanek i funkcji.3 Jednym z celów inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej jest wytwarzanie żywych tkanek i narządów do przeszczepów, ale z wyjątkiem cienkiej skóry i beznaczyniowej chrząstki,4 ograniczony sukces u ludzi został osiągnięty ze względu na złożoność biologii tkanek. Tradycyjne podejście inżynierii tkankowej obejmuje ładowanie komórek na stały porowaty biomateriał, zwany rusztowaniem, w obecności lub nieobecności czynników wzrostu, które zachęcają komórki do tworzenia pożądanych tkanek o złożoności biomimetycznej.5 Jednak pożądany rezultat jest rzadko osiągany, ponieważ trójskładnikowa mieszanina nie promuje odpowiednio tworzenia dobrze zdefiniowanego przestrzennego rozkładu komórek, czynników wzrostu i biomateriałów na poziomie mikroskali, który jest charakterystyczny dla struktury podobnej do tkanki. Druk trójwymiarowy (3D), znany również jako wytwarzanie addytywne (AM), jest bardzo obiecującym sposobem na przezwyciężenie tego ograniczenia w inżynierii tkankowej. Ponieważ jest to proces warstwa po warstwie, drukowanie 3D umożliwia tworzenie złożonych geometrii przy użyciu wielu materiałów (Rysunek 1). Druk 3D dla inżynierii tkankowej przekształcił się w nową technologię, zwaną biodrukowaniem, definiowaną jako "wykorzystanie procesów transferu materiałów do modelowania i montażu biologicznie istotnych materiałów, cząsteczek, komórek, tkanek i biodegradowalnych biomateriałów o określonej organizacji w celu osiągnięcia jednej lub więcej funkcji biologicznych."6 W szczególności, biodruk umożliwia spersonalizowaną i precyzyjną medycynę poprzez inżynierię anatomicznie ukształtowanych implantów o złożoności podobnej do tkanki przy użyciu własnych komórek pacjenta. Obecnie technologie biodruku 3D można podzielić na dwie kategorie: konstrukcje bezkomórkowe i komórkowe.7 Biodruk bezkomórkowy służy do wytwarzania rusztowania i samego biomateriału przy braku komórek podczas procesu drukowania. Biodruk bezkomórkowy oferuje wyższą dokładność i większą złożoność kształtu niż konstrukcje komórkowe, ponieważ warunki wytwarzania są mniej restrykcyjne niż metody wymagające utrzymania żywotności komórek. W przypadku biodruku komórkowego komórki i inne czynniki biologiczne są zintegrowane z materiałem podczas produkcji w celu wytworzenia żywych konstrukcji tkankowych. Oczywiste jest, że parametry drukowania, biomateriały i właściwości konstrukcji drukowanych w 3D są zatem różne w każdej kategorii ze względu na obecność lub brak komórek i substancji biologicznych. Poniżej pokrótce przedstawiamy i omawiamy te dwa podejścia w oparciu o odpowiednie materiały dla tych konstrukcji i procesy produkcyjne stosowane do ich wytwarzania. Omawiamy również obecne ograniczenia, potencjalne rozwiązania i przyszłe kierunki w bioprintingu.
Rysunek 1.Przegląd procesu drukowania 3D.
Produkcja rusztowań acellularnych
Rusztowanie acellularne składa się z porowatej struktury, która naśladuje mechaniczne i biochemiczne właściwości macierzy pozakomórkowej (ECM) i zapewnia mechaniczną integralność, a także szablon do mocowania komórek w celu stymulowania tworzenia tkanek.8 Rusztowania bezkomórkowe muszą wykazywać właściwości biokompatybilne i bioresorbowalne, a także biochemiczne, biofizyczne, biomechaniczne, bioelektryczne i biomagnetyczne.9 Ponieważ pory zapewniają miejsce na migrację komórek i wrastanie tkanek, ułatwiają tworzenie naczyń krwionośnych i poprawiają żywotność komórek,10 porowatość i porowate struktury są innymi kluczowymi cechami rusztowania. Tak więc zastosowanie AM jest bardzo korzystne, umożliwiając bardzo dokładną i powtarzalną kontrolę geometrii rusztowania (a tym samym porowatości), jednocześnie pozwalając na potencjalny montaż przestrzennej złożoności podobnej do tkanki. Zgłoszono szeroki zakres zastosowań bioprintowanych rusztowań acellularnych, takich jak tkanki mięśniowe, tkanki wątroby, chrząstki, kości, skóra itp.2 Konkretny materiał, który składa się na rusztowanie i wszelkie potencjalne czynniki biologiczne muszą zostać wybrane w celu odtworzenia natury zaprojektowanej tkanki. W tej sekcji skupiamy się na konstrukcjach o wysokiej wytrzymałości mechanicznej, typowych dla inżynierii kości. Materiały i procesy AM dla bezkomórkowych rusztowań opartych na miękkich tkankach inżynierskich (np. skóra, wątroba) są podobne do tych zawierających komórki i dlatego zostały opisane w sekcji "Wytwarzanie miękkich materiałów do enkapsulacji komórek" w dalszej części tego artykułu.
Materiały
Cztery kategorie materiałów są wyróżnione na podstawie ich charakteru chemicznego. Pierwsza kategoria to polimery,11 takie jak kolagen (Product No. C5483, C7624, H4417, itd.), fibryna (Product No. F5386), alginian, chitozan (Product No. 448869, 448877, 419419 itp.), poli(kwas mlekowy) (PLA) (nr produktu. 764590, 765112, 764698 itp.), poli(kwas glikolowy) (PGA) (nr produktu 457620 i 46746), polikaprolakton (PCL) i poli(fumaran propylenu) (PPF). Mogą one być wysoce bioresorbowalne i bardzo elastyczne pod względem składu chemicznego i przetwarzalności. Jednak rusztowania na bazie polimerów wykazują szybki spadek sztywności w czasie po wszczepieniu. Rusztowania ceramiczne na bazie fosforanu wapnia (CaPs) (nr produktu 21218), takie jak hydroksyapatyt (HA) (nr produktu. 289396, 677418, 693863 itp.) i fosforan β-trójwapniowy (β-TCP) (nr produktu. 13204, 21218 i 49963)12 były szeroko badane i wykorzystywane w zastosowaniach klinicznych.13 Rusztowania CaPs, będące głównym składnikiem kości, wykazują wysoką osteokonduktywność. Charakteryzują się również wysoką wytrzymałością na ściskanie, którą można nawet poprawić za pomocą dodatków domieszek, takich jak SiO2 (Nr produktu. 805890, 806587, 806765 itp.) lub ZnO (nr produktu 14439, 96479 itp.) Jednak ich przetwarzalność jest ograniczona, a zatem możliwe geometrie są ograniczone. Stosowane są również metale, zwykle tytan lub stal nierdzewna w celu zapewnienia biokompatybilności. Charakteryzują się one wysoką wytrzymałością mechaniczną, ale nie ulegają biodegradacji.13 Wreszcie, materiały kompozytowe zostały opracowane poprzez zmieszanie dwóch lub więcej materiałów w celu połączenia zalet każdego z nich w jeden. Jednym z przykładów jest kompozyt polimerowo-ceramiczny, taki jak PCL/TCP lub PCL/HA, w którym ceramika jest zintegrowana z polimerem w celu poprawy integralności mechanicznej i bioaktywności polimeru.14 Kompozyty wykazują obiecujące wyniki dla rusztowań acellularnych, a wiele potencjalnych kombinacji pozostaje do zbadania.
Proces produkcji
Od lat 80-tych XX wieku opracowano i skomercjalizowano liczne procesy druku 3D i AM,15,16 takie jak stereolitografia (SLA), selektywne spiekanie laserowe (SLS) i modelowanie topionego osadzania (FDM). Te techniki drukowania mogą być stosowane do biodruku rusztowań acellularnych, ponieważ wymagają mniej restrykcyjnych środków ostrożności, takich jak prędkość, temperatura, toksyczność i ciśnienie do drukowania.
SLA polega na odchylaniu wiązki laserowej w płaszczyźnie poziomej w celu utwardzenia materiału światłoczułego w celu utworzenia stałej warstwy.16 Warstwa ta jest następnie przesuwana wzdłuż osi pionowej, aby umożliwić utworzenie następnej sąsiedniej warstwy, jak pokazano na Rysunku 2. Technologia ta umożliwia drukowanie w wysokiej rozdzielczości, przy grubości warstwy tak małej jak 20 μm. W płaszczyźnie poziomej rozdzielczość jest określona przez średnicę lasera (około 250 μm); zastosowanie cyfrowej projekcji światła (DLP) zamiast lasera może poprawić rozdzielczość do 70 μm. Jednak SLA ogranicza skład biochemiczny konstrukcji do jednego materiału, który musi być również światłoczuły.
SLS, w przeciwieństwie do tego, wykorzystuje laser o dużej mocy (Rysunek 2) do podgrzania i stopienia materiału na bazie proszku. Poprzez rastrowanie lasera nad złożem proszku wytwarzane są kolejne warstwy. Gdy każda warstwa zostanie ukończona, kolejna warstwa proszku jest dodawana na wierzch poprzedniej, a następnie spiekana przez laser w celu utworzenia następnej warstwy. Powtarza się to aż do wyprodukowania całej części.16 Rusztowania wytwarzane przy użyciu SLS wykazują wysoką wytrzymałość mechaniczną i złożoność kształtu, ponieważ spiekanie zapewnia lepsze wiązania między każdą warstwą, a obecność niespiekanego proszku zapewnia wsparcie dla każdej kolejnej warstwy. Rozdzielczość i wykończenie powierzchni mogą się różnić w zależności od proszku.
Drukowanie 3D przy użyciu FDM polega na pozycjonowaniu dyszy wytłaczającej w celu osadzenia pasm materiału w przestrzeni 3D. Wytłaczany materiał jest topiony termicznie wewnątrz dyszy, zestalając się po schłodzeniu po osadzeniu w celu utworzenia warstwy (Rysunek 2). Materiały używane do FDM muszą wykazywać fazę stopioną, dzięki czemu niektóre polimery i kompozyty dobrze nadają się do tego procesu. Ponieważ proces ten opiera się na splotach, jest on bardzo odpowiedni dla struktur porowatych. Jednak skomplikowane geometrie, takie jak wystające warstwy, są trudne do wytworzenia.
Rysunek 2.Procesy druku 3D do produkcji rusztowań acellularnych.
Manufacturing Soft Materials for Cell Encapsulation
Chociaż rusztowania acellularne mogą zapewnić mechaniczne wsparcie i strukturalne wskazówki dla wzrostu komórek, po przetworzeniu wymagane jest wysiewanie komórek i/lub ładowanie biomolekuł, jeśli komórki i/lub biomolekuły muszą być przymocowane do rusztowania. Jest to delikatne zadanie i nie pozwala na kontrolowane mocowanie i przestrzenne rozmieszczenie komórek i biomolekuł w rusztowaniu. Jednakże, ładowanie jest łatwiejsze do osiągnięcia poprzez enkapsulację komórek i/lub biomolekuł bezpośrednio w drukowanym materiale. Łącząc różne typy komórek i czynniki wzrostu zgodnie z zaprojektowanymi wzorcami biomimetycznymi, można uzyskać wysoce złożone konstrukcje tkankowe.2 Takie konstrukcje tkankowe mają wiele zastosowań, umożliwiając znaczny postęp w kierunku miniaturowych modeli tkanek 3D do testów dostarczania leków. Aby sprostać potrzebom tych wymagających zastosowań, wymagane są jednak sterylne warunki, nietoksyczne materiały, łagodne procesy produkcyjne i stosunkowo krótkie okna czasowe przetwarzania, co ma wpływ zarówno na wybór materiału, jak i proces drukowania.
Materiały
Enkapsulacja komórek wymaga, aby materiał do drukowania miał wysoką zawartość wody i wystarczającą porowatość, aby umożliwić komórkom otrzymywanie składników odżywczych i tlenu ze środowiska, a także usuwanie odpadów w celu utrzymania życia. Materiał powinien być miękki i biodegradowalny, aby umożliwić komórkom rozprzestrzenianie się, migrację, proliferację i interakcję między sobą.17 Najczęściej stosowanymi materiałami do enkapsulacji komórek są hydrożele, które mogą być naturalne lub syntetyczne. Naturalne hydrożele, takie jak żelatyna i kolagen, są ekstrahowane z tkanek zwierzęcych lub ludzkich, wykazując wewnętrzne interakcje molekularne z komórkami. Syntetyczne hydrożele, takie jak poli(glikol etylenowy) lub PEG, są szeroko stosowane w biodruku ze względu na elastyczność ich właściwości fizycznych. W zależności od zasady żelowania, hydrożele można podzielić na dwie kategorie: hydrożele fizyczne i chemiczne.15 Hydrożel jest tworzony "fizycznie" poprzez zmianę temperatury, wartości pH lub innych właściwości fizycznych, podczas gdy "chemiczny" hydrożel jest wytwarzany przez sieciowanie za pomocą wiązań kowalencyjnych. W pierwszym przypadku hydrożel może powrócić do stanu ciekłego, jeśli właściwość fizyczna zostanie zmieniona z powrotem do stanu początkowego; podczas gdy w drugim przypadku żelowanie jest nieodwracalne ze względu na nierozpuszczalną w wodzie sieć utworzoną przez utworzone wiązania kowalencyjne. Sieciowanie chemiczne uzyskuje się przez zmieszanie dwóch wzajemnie reaktywnych chemikaliów, podczas gdy fotosieciowanie przeprowadza się przez wystawienie roztworu złożonego z światłoczułego polimeru i fotoinicjatora na działanie światła widzialnego lub UV.16
Proces produkcyjny
Biodrukowanie oparte na technologii Inkjet jest szeroko stosowane do tworzenia trójwymiarowych konstrukcji wypełnionych komórkami poprzez ciągłe wyrzucanie kropelek wypełnionych komórkami na etap docelowy za pomocą siłownika termicznego lub akustycznego. Charakter głowicy drukującej sprawia, że konstrukcja 3D jest budowana kropka po kropce dla każdej warstwy. Biodrukarki atramentowe są powszechne w zastosowaniach biodrukowania, ponieważ charakteryzują się dużą prędkością drukowania, są kompatybilne z komponentami biologicznymi i są tanie. Przy wyborze tej metody drukowania należy wziąć pod uwagę lepkość materiału drukarskiego, aby ograniczyć zatykanie głowicy drukującej.
SLA może być również stosowany do wytwarzania konstrukcji wypełnionych komórkami poprzez dodanie komórek do nieusieciowanego materiału polimerowego. Światło widzialne jest preferowanym źródłem światła do sieciowania przy użyciu DLP ze względu na wrażliwość komórek na promieniowanie UV i zmiany temperatury. Podczas gdy SLA oferuje wysoką rozdzielczość, należy wziąć pod uwagę kompromis między jakością druku a całkowitym czasem przetwarzania, aby uzyskać optymalne warunki dla żywotności komórek. SLA wymaga większej ilości materiału niż inne metody biodruku ze względu na wymóg wypełnienia kadzi (Rysunek 3) materiałem drukarskim, co stanowi główną wadę w przypadku stosowania drogich materiałów.
Innym sposobem drukowania konstrukcji hydrożelowych jest wytłaczanie. W tym celu komora jest wypełniana biomateriałem obciążonym komórkami, a następnie za pomocą wytłaczania pneumatycznego lub tłokowego materiał jest przepychany przez głowicę drukującą. Aby utworzyć konstrukcje wypełnione komórkami warstwa po warstwie, głowica drukująca automatycznie podąża żądaną ścieżką. W przypadku fizycznie uformowanego hydrożelu rozpórki są wytłaczane i żelowane na scenie po zmianie pH, temperatury lub innych warunków fizycznych. W tym procesie można również stosować materiały fotosieciujące. Po wytłoczeniu warstwy roztworu polimeru wstępnego jest ona sieciowana przez wystawienie na działanie światła. Chociaż prędkość drukowania i ilość wytłaczania można precyzyjnie kontrolować, znaczne naprężenia ścinające na materiale mogą wpływać na żywotność komórek i należy ich starannie unikać.
Biodruk laserowy jest powszechnie stosowaną techniką, w której laser jest używany do przenoszenia materiałów wypełnionych komórkami z płytki źródłowej do etapu osadzania. Aby osiągnąć ten transfer, płytka źródłowa jest pokryta podwójną warstwą z warstwą pochłaniającą laser i warstwą donorową biomateriału (Rysunek 3). Gdy impuls lasera skupia się na warstwie pochłaniającej laser, podgrzany obszar generuje pęcherzyk, który napędza i osadza kroplę biomateriału na etapie docelowym. Zastosowanie lasera zamiast dyszy pozwala na osadzanie materiałów o wysokiej lepkości z dużą dokładnością. Jednak ciepło generowane przez laser utrudnia żywotność komórek, a proces ten jest najbardziej ograniczony pod względem konstrukcji pionowych.
Rysunek 3.Proces druku 3D do produkcji miękkich materiałów do enkapsulacji komórek.
Obecne wyzwania i perspektywy
Przedstawiliśmy krótki przegląd aktualnego stanu wiedzy w dziedzinie biodruku w oparciu o dwa dominujące podejścia. W pierwszym podejściu, rusztowania bezkomórkowe są wykorzystywane do zapewnienia wysokiej rozdzielczości i wysoce powtarzalnych szablonów do implantacji w celu promowania funkcji komórek i regeneracji tkanek. W drugim podejściu komórki są enkapsulowane bezpośrednio w materiale w celu integracji wewnątrz konstrukcji podczas drukowania. Materiały stosowane w tej metodzie zawierają wysoki stosunek wody, a zatem są uważane za materiały miękkie pod względem sztywności. Podczas gdy pierwsze podejście zostało celowo poświęcone sztywniejszym materiałom w tej sekcji, należy zauważyć, że rusztowania acellularne oparte na miękkich materiałach można również uzyskać przy użyciu procesów opisanych we wcześniejszej sekcji "Wytwarzanie miękkich materiałów do enkapsulacji komórek". Na przykład, jak wspomniano wcześniej, obecne podejścia do biodruku 3D mają ograniczone możliwości integracji miękkich i sztywnych wielofunkcyjnych komponentów wymaganych dla tkanek i narządów ze względu na ich nieodłączną heterogeniczność pod względem właściwości mechanicznych, fizycznych, chemicznych i biologicznych oraz funkcji. Jako krok w tym kierunku, nasze laboratorium opracowało hybrydową biodrukarkę 3D (Hybprinter), która może w sposób ciągły i szybki integrować miękkie materiały wypełnione komórkami i sztywne materiały szkieletowe przy użyciu technik FDM, SLA i wytłaczania w kontrolowany i zautomatyzowany sposób w ramach jednej platformy.18 Korzystając z każdego procesu, jesteśmy w stanie wytwarzać konstrukcje zarówno z rusztowaniami acellularnymi, jak i hydrożelami wypełnionymi komórkami, co stanowi krok w kierunku wysoce złożonych konstrukcji wielomateriałowych.
Podczas gdy biodruk jest obiecujący w inżynierii tkankowej, wymagane są ulepszenia w procesach drukowania. Należy rozważyć zwiększenie prędkości w celu ułatwienia skalowania rusztowań bezkomórkowych i poprawy żywotności komórek w przypadku konstrukcji obciążonych komórkami. Ponadto wymagana jest wyższa rozdzielczość, w szczególności w przypadku wytwarzania heterogenicznych tkanek kompozytowych i tkanek unaczynionych. Unaczynienie jest jednym z kluczowych elementów i prawdopodobnie największym wyzwaniem inżynierii tkankowej.19 Takie tkanki składają się z bardzo złożonej sieci naczyniowej, od milimetrowych naczyń krwionośnych do mikrometrowych naczyń włosowatych. Odtworzenie takiej sieci jest ogromnym wyzwaniem i do tej pory zajmowano się nim głównie poprzez zapewnienie wystarczającej przestrzeni w porowatym rusztowaniu dla spontanicznego rozwoju tkanek naczyniowych. Proces druku 3D, taki jak polimeryzacja dwufotonowa20, pozwala na wytwarzanie części o rozmiarach od mikrona do milimetra i dlatego jest uważany za obiecujący proces biodruku do produkcji unaczynionych konstrukcji tkankowych.
Badania powinny również skupić się na opracowaniu nowych materiałów, które mają lepsze właściwości biologiczne i nadają się do biodruku. Dodatkowo, badania powinny koncentrować się na wykorzystaniu obecnych lub przyszłych technologii w celu poprawy montażu istniejących biomateriałów, aby lepiej naśladować złożoność ECM, lub kombinacji obu. Dostępne materiały do budowy tkanek wypełnionych komórkami dedykowane do biodruku są obecnie ograniczone, ale ulepszone możliwości obrazowania i fundamentalne obecnie ograniczone, ale ulepszone możliwości obrazowania i fundamentalne zrozumienie złożoności tkanek i biologii rozwoju przyczynią się do rozwoju nowych materiałów i technologii biodruku. Dopiero okaże się, w jakim stopniu biomimetyczna złożoność konstrukcji biodrukowanych pod względem chemicznym lub fizycznym jest niezbędna do osiągnięcia lepszego gojenia i przywrócenia utraconych funkcji.
Rośnie liczba zastosowań AM, a biodruk staje się jednym z najbardziej obiecujących i wymagających procesów produkcyjnych ze względu na potencjalny wpływ na globalne problemy opieki zdrowotnej, takie jak starzenie się, przeszczepianie narządów, terapia raka oraz spersonalizowana i precyzyjna medycyna. W przyszłości biodruk może stać się zarówno źródłem miniaturowych modeli chorób i toksykologii dla przemysłu farmaceutycznego, jak i źródłem naturalnej wielkości zamienników tkanek / narządów do leczenia klinicznego.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować za wsparcie finansowe następujących agencji: NIH R01AR057837 (NIAMS), NIH R01DE021468 (NIDCR), DOD W911NF-14-1-0545 (DURIP), DOD W81XWH-10-1-0966 (PRORP), oraz Stanford Coulter Translational Seed Grant.
Referencje
Zaloguj się lub utwórz konto, aby kontynuować.
Nie masz konta użytkownika?